一、课程基本属性
课程编码：
1102025B，1102115
课程中文名称：
细胞生物学
课程英文名称：
Cell biology
课程类别：
学科基础
课程性质：
核心课程
总学时/学分：
64学时/4学分
讲课学时/学分：
40学时/2.5学分
实验学时/学分：
24学时/1.5学分
课内实践学时/学分：
学时/ 学分
开课单位：
生命科学学院
开设学期：
适用专业及类型：
生物技术、生物科学卓越班
先修课程：
主撰人：
韩冰、刘迎春
主审人：
韩冰
制定时间：
2017年 6 月15 日
二、课程简介与教学目标
（一）课程简介
细胞生物学是生命科学的核心学科，在我国基础科学发展规划中列为生命科学的四大基础学科之一。细胞生物学课程为生命科学其它课程提供必要的理论和实践基础。其任务是使学生理解怎样以细胞作为生命活动的基本单位探索生命活动的规律,了解细胞内进行物质、能量代谢和信息传递的物质结构基础，以及细胞进行生命活动的基本规律。同时，通过实验课的学习，使学生了解现代细胞生物学的研究方法和手段，掌握基本的实验方法与技能。
（二）课程教学目标
通过本课程的教学应实现以下目标：使学生既掌握本学科的发展简史和前沿领域，又掌握细胞生物，同时使学生学会学习。
——了解该课程的相关基础知识、基本概念和基本理论，使学生受到基本科学思维训练；
——熟悉该课程的相关实验思路和实验技术；
——掌握该课程的发展简史和前沿领域，具有自我开拓可获得知识和利用信息的能力。
三、教学内容与基本要求
（一）课程内容与课时分配
表1 课程内容与课时分配
章次或序号
主要知识单元
学时分配
理论
实验
习题
实习
讨论
……
1
第一章细胞生物学发展史及基础知识概要
第一节细胞生物学研究内容
第二节细胞基本共性
3
2
第二章细胞生物学实验技术
第一节细胞形态结构的观察方法
第二节细胞组分的研究方法
第三节细胞培养、细胞工程与显微镜操作技术
第四节生物化学与分子生物学技术
4
第三章细胞质膜
第一节细胞质膜的化学组成与结构模型
第二节膜骨架与细胞表面的特化结构
第四章跨膜运输
第一节被动运输
第二节主动运输
第三节胞吞作用和胞吐作用
5
第五章线粒体与叶绿体
第一节线粒体与氧化磷酸化
第二节叶绿体与光合作用
第三节线粒体与叶绿体的半自主性
第四节线粒体与叶绿体的增殖与起源
6
第六章细胞质基质、内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输
第一节细胞质基质
第二节内质网
第三节高尔基复合体
第四节溶酶体与过氧化物酶体
第五节细胞内蛋白质膜泡运输
7
第七章细胞骨架
第一节微管
第二节微丝
第三节中间纤维
8
第八章细胞核与染色体
第一节细胞核的一般知识
第二节核被膜与核孔复合体
第三节染色体与染色质
第四节核仁及核基质
9
第九章核糖体
第一节核糖体的类型和概况
第二节多聚核糖体与蛋白质的合成
10
第十章细胞信号转导
第一节概述
第二节细胞内受体介导的信号转导
第三节 G蛋白偶联型受体介导的信号转导
第四节酶连受体介导的信号转导
第五节信号的整合和控制
11
第十一章细胞增殖及调控
第一节细胞周期特点与调控
第二节细胞增殖调控的因素
12
第十二章细胞分化与癌细胞
第一节细胞分化与细胞的发育潜能
第二节细胞分化与基因表达
第三节癌细胞
13
第十三章细胞衰老与凋亡
第一节细胞的衰老
第二节细胞凋亡
14
第十四章细胞社会的联系：细胞连接、细胞粘着和细胞外基质
第一节细胞外基质
第二节细胞粘着因子
第三节细胞连接
合计
62
注：“学时分配”涉及的项目根据教学实际进行设置、调整。
（二）教学基本要求
主要知识单元1: 第一章 细胞生物学发展史及基础知识概述
一．教学内容
（一）发展历史
了解显微镜的发明与细胞的发现，了解细胞学说的提出。理解现代生命科学的发展趋势及细胞生物学的总趋势与重点领域。
（二）细胞生物学研究的内容与现状
理解细胞学说的概念；细胞生物学的形成和发展；当代细胞生物学研究内容与学习方法；对未来的展望。掌握细胞超微结构研究的意义及细胞生物学的主要研究内容。
细胞的基本概念
理解细胞的基本共性，细胞的形态与大小的关系，掌握细胞是生命活动的基本单位。
真核细胞与原核细胞的结构
理解并掌握真核细胞与原核细胞的差异，动物细胞与植物细胞的差异。
二．重点或难点
（一）教学重点：
细胞是生命活动的基本单位。细胞的形态与大小。细胞的基本共性。真核细胞与原核细胞的差异，动物细胞与植物细胞的差异。
（二）教学难点：
细胞是生命活动的基本单位。
三．教学目标
（一）了解当代细胞生物学学习方法；细胞生物学的研究内容和发展趋势，以及研究的前沿热点问题。
（二）理解细胞生物学的形成和发展。
（三）掌握显微镜的发明与细胞的发现、细胞学说的提出。
本章计划3学时。
四．思考与练习
（一）为什么说细胞是生命活动的基本单位？
（二）细胞有哪些基本共性？
（三）比较真核细胞与原核细胞的区别？
（四）比较动物细胞与植物细胞的区别？
主要知识单元2: 第二章 细胞生物学实验技术
（一）光学显微镜
了解光学显微镜的原理，掌握光学显微镜的使用方法。
（二）电子显微镜
了解电子显微镜的原理，理解电子显微镜的使用方法。
（三）扫描隧道显微镜
了解扫描隧道显微镜的原理，理解扫描隧道显微镜的使用方法。
（一）离心技术
理解离心技术，掌握基本离心方法在细胞组分分离上的应用。
（二）流式细胞术
了解流式细胞术。
（三）细胞电泳
了解细胞电泳方法及应用。
鉴于此部分有相关课程的内容详细介绍，在此只作简要介绍。
（一）细胞化学技术及免疫细胞化学技术
了解该技术的要点，并了解该技术在细胞生物学研究中的应用。
（二）显微光谱分析技术及放射自显影术
（三）分子杂交技术、PCR技术
显微镜的原理和使用，细胞组分的研究方法。
细胞培养、细胞工程与显微镜操作技术。生物化学与分子生物学技术。
（一）了解显微技术，包括各类光学显微镜、电子显微镜、扫描隧道显微镜的原理、特性和应用范围。
（二）理解细胞组分分离技术。细胞化学技术、免疫细胞化学技术、显微光谱分析技术、放射自显影术、分子杂交技术、PCR技术等。
（三）掌握细胞培养、细胞工程与显微镜操作技术的要点及应用。
本章计划2学时。
（一）简述电子显微镜、扫描隧道显微镜的原理、特性和应用范围。
（二）研究细胞组分的方法主要有哪些？
主要知识单元3: 第三章 细胞质膜
（一）质膜的化学组成及分子结构模型
了解细胞的分子结构模型的发现，掌握质膜的化学组成特征、流动镶嵌模型的特点、脂筏模型的内容。
（二）质膜结构的主要特征及功能
掌握质膜结构主要特征；理解质膜的功能；了解脂质体的概念及应用。
（一）细胞表面的特化结构
理解细胞表面的特化结构及生物学意义。
（二）细胞膜骨架的结构及功能
理解并掌握细胞膜骨架的结构及功能。
流动镶嵌模型的特点，脂筏模型的内容。质膜的功能，质膜的化学组成及质膜结构的主要特征。细胞膜的特化结构及功能。细胞膜骨架的结构及功能。
质膜的化学组成及质膜结构的主要特征。细胞膜的特化结构及功能。细胞膜骨架的结构及功能。
（一）了解学习细胞膜的分子结构模型的发现；流动镶嵌模型的特点；脂筏模型的内容。
（二）理解质膜的功能；质膜的化学组成及质膜结构的主要特征。
（三）掌握细胞膜的特化结构及功能；细胞膜骨架的结构及功能。
（一）细胞表面的特化结构有哪些？
（二）简述膜的特性及其生物学意义。
（三）简述锚定蛋白、血影蛋白的功能。
主要知识单元4: 第四章 物质的跨膜运输
（一）简单扩散
理解并掌握简单扩散的概念及特点。
（二）协助扩散
理解并掌握协助扩散的概念及特点。
（一）钠钾泵
掌握主动运输的种类及概念，理解并掌握钠钾泵的结构、功能与分布。
（二）钙离子泵、质子泵
理解并掌握钙离子泵、质子泵等离子泵的结构、功能与分布。
（三）协同运输
理解并掌握协同运输的概念和生物学意义。
（一）胞吞作用
理解并掌握胞吞作用的概念和生物学意义。
（二）胞吐作用
理解并掌握胞吐作用的概念和生物学意义。
（三）跨细胞运输
理解并掌握跨细胞运输的概念和生物学意义。
简单扩散、协助扩散的特点及简单扩散、协助扩散的概念。主动运输的种类。钠钾泵、钙离子泵、质子泵等离子泵的结构、功能与分布。大分子物质及颗粒性物质进出细胞的方式、跨细胞运输的意义。膜泡运输的基本概念与特点。
钠钾泵、钙离子泵、质子泵等离子泵的结构、功能与分布。
（一）了解简单扩散、协助扩散的概念。
（二）理解主动运输的种类；主动运输、协同运输的概念。
（三）掌握钠钾泵、钙离子泵、质子泵等离子泵的结构、功能与分布；大分子物质及颗粒性物质进出细胞的方式；跨细胞运输的意义；膜泡运输的基本概念与特点。
（一）名词解释：简单扩散；协助扩散；钠钾泵；钙离子泵；质子泵；膜泡运输；吞噬作用；胞饮作用；外排作用；ABC 转运器；协同运输；穿胞运输。
（二）什么叫主动运输、被动运输？各有何特点？
（三）试举2例说明离子泵的生物学意义。
主要知识单元5: 第五章 线粒体与叶绿体
（一）线粒体的形态结构与酶的定位
了解氧化磷酸化；理解线粒体的化学组成与酶的定位；掌握线粒体的形态结构及功能。
（二）线粒体的功能
掌握线粒体的功能。
（一）叶绿体的形态结构及化学组成
了解光合作用原理；理解并掌握叶绿体的形态结构及化学组成。
（二）叶绿体的功能
理解并掌握叶绿体的功能。
（一）线粒体、叶绿体的DNA及蛋白质合成
理解并掌握线粒体与叶绿体的DNA及蛋白质合成。
（二）线粒体与叶绿体的半自主性
了解线粒体与叶绿体的半自主性。
（一）线粒体与叶绿体的增殖
理解个体发育中线粒体与叶绿体的增殖方式。
（二）线粒体与叶绿体的起源（学生自学）
线粒体的化学组成与酶的定位；线粒体的形态结构及功能。光合作用原理，叶绿体的形态结构及功能。线粒体与叶绿体的DNA。个体发育中线粒体与叶绿体的增殖。
氧化磷酸化，线粒体的化学组成与酶的定位；线粒体的形态结构及功能；光合作用，叶绿体的形态结构及功能定位。
（一）了解线粒体与叶绿体的DNA及蛋白质合成；线粒体与叶绿体的增殖和起源。
（二）理解氧化磷酸化、线粒体的化学组成与酶的定位线粒体与叶绿体的半自主性。
（三）掌握线粒体的形态结构及功能；光合作用；叶绿体的形态结构及功能。
（一）简述线粒体的超微形态结构与功能。
（二）简述线粒体的化学组成与酶的定位。
（三）叶绿体的形态结构与功能。
（四）名词解释：类囊体；基粒类囊体；基质类囊体。
（五）为何说线粒体与叶绿体是半自主性的细胞器？
（六）关于线粒体与叶绿体的起源有哪些重要的假说？
主要知识单元6: 第六章 细胞质基质、内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输
（一）细胞质基质的涵义，胞质溶胶的含义
理解细胞质基质的涵义，胞质溶胶的含义。
（二）细胞质基质的组成及功能
理解并掌握细胞质基质的组成及功能。掌握内膜系统的概念。
（一）内质网的形态结构与类型
了解并掌握内质网的形态结构、类型。
（二）内质网的功能
理解并掌握内质网的功能。了解内质网与基因表达的调控的关系。
（一）高尔基体的形态结构
了解并掌握高尔基体的形态结构特点。
（二）高尔基体的功能
理解并掌握高尔基体的功能。
（一）溶酶体的结构类型与发生
理解并掌握溶酶体的类型、功能与发生。
（二）过氧化物酶体、液泡系、圆球体和糊粉粒
了解并掌握溶酶体与过氧化物酶体，圆球体和糊粉粒的发生、功能。
第五节细胞内蛋白质的分选与细胞结构的装配
了解细胞结构体系的装配；理解蛋白质分选的基本途径与类型；掌握信号假说与蛋白质分选信号。
细胞质基质的涵义及功能，胞质溶胶的含义。内质网的形态结构与类型，内质网的功能、与基因表达调控的关系。高尔基体的形态结构及功能。溶酶体、过氧化物酶体、圆球体和糊粉粒的发生及功能。细胞结构体系的装配。蛋白质分选的基本途径与类型。信号假说与蛋白质分选信号。
内质网的功能、与基因表达调控的关系。高尔基体的形态结构及生物学功能。溶酶体与过氧化物酶体功能与发生。圆球体和糊粉粒的功能与发生。信号假说与蛋白质分选信号。
（一）了解细胞质基质及胞质溶胶的含义；细胞质基质的功能。
（二）理解内质网的形态结构、类型与功能、内质网与基因表达的调控、高尔基体的形态结构、高尔基体的功能、溶酶体与过氧化物酶体、圆球体和糊粉粒、溶酶体的功能与发生、细胞结构体系的装配；
（三）掌握蛋白质分选的基本途径与类型、信号假说与蛋白质分选信号。
本章计划6学时。
（一）简述细胞质基质的组成及涵义，其主要生物学功能有哪些？
（二）简述内膜系统的概念。
（三）简述内质网的形态结构与功能。
（四）简述高尔基体的三维形态结构及生物学功能。
（五）简述溶酶体的结构类型与功能。
（六）名词解释：初级溶酶体；次级溶酶体；残余小体。
主要知识单元7: 第七章 细胞骨架
（一）微管的形态结构与分布
理解并掌握微管的分子结构与分布。
（二）微管的装配及功能
理解并掌握微管的装配与生物学功能。
（一）微丝的形态结构与分布
理解并掌握微丝的分子结构与分布。
（二）微丝的装配及功能
理解并掌握微丝的装配及功能。
（一）中间纤维蛋白分子的结构特征及其装配
理解并掌握中间纤维的分子结构、装配、分布、功能。
（二）中间纤维功能及在生物进化中的意义
了解中间纤维在生物进化中的起源与意义。
第四节细胞核骨架
（一）核基质（见十一章）
（二）染色体支架
理解并掌握细胞核骨架、染色体骨架的概念。
微管的分子结构、装配、分布、功能。微丝的分子结构、装配、分布、功能。中间纤维在生物进化中的起源；中间纤维的分子结构、装配、分布、功能。细胞核骨架、染色体骨架的概念。
微管的分子结构、装配、分布、功能。微丝的分子结构、装配、分布、功能。中间纤维在生物进化中的起源；中间纤维的分子结构、装配、分布、功能。
（一）了解微管、微丝和中间纤维的分子结构、装配、分布、功能。
（二）理解各细胞骨架的踏车现象和极性特点及细胞骨架功能。
（三）掌握细胞核骨架、染色体骨架的概念。
本章计划4学时。
（一）名词解释：细胞骨架；细胞核骨架；染色体骨架。
（二）微丝的形态结构与分布。
（三）微丝的功能。
（四）中间纤维的形态，分布及化学组成特点。
（五）中间纤维的功能。
主要知识单元8: 第八章 细胞核与染色体
（一）核的功能及重要性
理解核的功能及重要性。
（二）核的形态，大小和数目
掌握核的形态，大小和数目。
（三）间期核的结构组成
理解并掌握间期核的结构组成。
（一）核被膜
掌握核被膜的组成。
（二）核孔复合体
了解核孔复合体的结构模型。理解并掌握核孔复合体的功能及蛋白质门控运输。
掌握染色质的化学组成、结构、异染色质和常染色质的区别、染色体的组装；核小体的结构。
理解并掌握核仁的功能及核糖体的生物发生过程。理解核基质的概念及组成。
二．重点、难点提示和教学手段
细胞核的功能及重要性；核的形态，大小和数目；核被膜的组成。核孔复合体的结构模型及蛋白质门控运输。染色质的概念及类型；染色质的化学组成、结构、异染色质和常染色质的区别、染色体的组装；核小体的结构及染色体的压缩。
核孔复合体的结构模型及蛋白质门控运输。
（一）了解学习间期核的结构组成；核的的形态、功能及重要性；核被膜的组成。
（二）理解核孔复合体的结构模型；核孔复合体的功能及蛋白质门控运输。
（三）掌握染色质的概念及类型；染色质的化学组成、结构、异染色质和常染色质的区别、染色体的组装；核小体的结构。
（一）名词解释：核孔复合体；染色质；染色体；异染色质；常染色质；核小体；组蛋白。
（二）简述核孔复合体的结构模型及蛋白质门控运输。
（三）核小体结构特点。
主要知识单元9: 第九章 核糖体
第一节核糖体的概况
（一）核糖体的基本类型与成份
理解核糖体的基本类型与成份。
（二）核糖体的结构及功能
掌握核糖体的结构。r蛋白质与rRNA的功能。
（一）多聚核糖体
理解多聚核糖体的概念。多聚核糖体与蛋白质的合成。
（二）RNA在生命起源中的地位（学生自学）
了解RNA在生命起源中的地位。
核糖体的结构。r蛋白质与rRNA的功能。多聚核糖体与蛋白质的合成。
r蛋白质与rRNA的功能。RNA在生命起源中的地位。
（一）了解核糖体的基本类型与成份……
（二）理解RNA在生命起源中的地位……
（三）掌握核糖体的结构；r蛋白质与rRNA的功能；多聚核糖体的概念。
本章计划1学时。
（一）核糖体的基本类型与结构。
（二）简述r蛋白质与rRNA的功能。
（三）多聚核糖体的概念。
主要知识单元10: 第十章 细胞信号转导
第一节基本概念；
（一）细胞通讯、细胞识别、信号转导
掌握细胞通信相关的概念，细胞信号分子、受体、蛋白激酶特点、功能。
（二）细胞识别的装置
掌握细胞识别的装置。
第二节信号传递通路
（一）通过细胞表面受体介导的信号跨膜传递
掌握胞间通信的主要类型。掌握膜表面受体介导的信号转导，包括离子通道型受体、G蛋白耦联型受体、酶耦联型受体介导的信号转导。了解各信号通路间的“交叉会话”。
（二）通过细胞内受体介导的信号传递
掌握胞内受体介导的信号传导。了解胞内受体的种类及共性。理解甾类激素、NO等信号分子作用特点和信号传递途径。
离子通道型受体、G蛋白耦联型受体、酶耦联型受体介导的信号转导。胞内受体介导的信号传导。NO信号分子作用特点和信号传递途径。
离子通道型受体、G蛋白耦联型受体、酶耦联型受体介导的信号转导。胞内受体介导的信号传导。细胞信号转导的复杂性及各信号之间的“交叉会话”。
（一）了解细胞通信相关的概念；细胞信号分子、受体、蛋白激酶特点、功能。
（二）理解细胞通信相关的概念。
（三）掌握胞间通信的主要类型；膜表面受体介导的信号转导，包括离子通道型受体、G蛋白耦联型受体、酶耦联型受体介导的信号转导；掌握胞内受体介导的信号传导。
（一）细胞有哪些通讯方式？各种通讯方式有何不同？
（二）何谓细胞信号传递中的分子开关蛋白？举例说明其作用机理。
（三）说明化学信号分子的类型和特点。
（四）简要说明G-蛋白偶联受体介导的信号通路有何特点？
（五）概述受体酪氨酸激酶介导的信号通道的组成、特点及其主要功能。
（六）试述cAMP对蛋白质可逆磷酸化的调节及其在糖原代谢中的意义。
（七）试述肌醇磷脂如何通过调节钙流传递信号。
（八）试述细胞Ca2+ 的分布和细胞质膜、内质网和线粒体上的Ca2+ 转移系统及胞质中Ca2+ 信号的产生、灭活及时空多样性。
（九）总结细胞信号传递的主要特点并举例说明。
主要知识单元11: 第十一章 细胞增殖及调控
（一）基本概念及细胞周期各时期的特点
理解细胞周期的概念、细胞周期时间的测定、细胞同步化的概念，了解细胞同步化的方法。
（二）有丝分裂及减数分裂
复习、回顾有丝分裂与减数分裂的过程、特点。
第二节细胞周期的调控
（一）细胞周期调控因子——MPF
掌握成熟促进因子MPF、细胞周期蛋白的功能。
（二）细胞周期运转的调控
掌握细胞周期调控的主要机制。
第三节细胞增殖调控的因素
（一）生长因子及其受体
理解生长因子及其受体对细胞增殖调控的基本原理。
（二）癌基因与抑癌基因
理解CDC的激活与抑制、Cyclin的周期变化、细胞周期调控点。
（三）信使系统与细胞增殖
了解信号转导系统对细胞增殖调控的基本机制。
三．重点或难点
细胞周期的概念、细胞周期时间的测定、细胞同步化；细胞周期的调控，包括成熟促进因子MPF、细胞周期蛋白的功能；细胞周期调控的主要机制、CDC的激活与抑制、Cyclin的周期变化、细胞周期调控点，肽类生长因子对细胞增殖的影响。
细胞周期调控的主要机制、CDC的激活与抑制、Cyclin的周期变化、细胞周期调控点。肽类生长因子对细胞增殖的影响。
（一）了解有丝分裂与减数分裂的过程、特点。
（二）理解细胞周期时间的测定、细胞同步化的概念与方法。
（三）掌握细胞周期的概念。
（一）名词解释：细胞周期；细胞同步化；细胞周期蛋白。
（二）细胞周期调控的主要机制。
（三）简述细胞增殖调控的主要因素有哪些。
主要知识单元12: 第十二章 细胞分化与癌细胞
（一）细胞分化的基本概念
掌握细胞分化的概念。理解细胞全能性、细胞分化的机理、成体中的细胞分化、再生。
（二）影响细胞分化的因素
了解细胞分化的主要机制，包括细胞不对称分裂、相关信号转导以及细胞行为。
（一）细胞分化的实质
理解细胞分化的实质。
（二）细胞分化与基因本身的变化
理解细胞分化与基因本身的变化的关系。
一、癌细胞的主要特征
理解、掌握癌细胞的主要特征。
二、致癌因素
了解引发细胞癌变的因素。
细胞分化的主要机制，包括细胞不对称分裂、相关信号转导以及细胞行为；细胞全能性、细胞分化的机理。成体中的细胞分化、再生。癌细胞的主要特征；细胞癌变的机制。
细胞分化与基因本身的变化的关系。
（三）教学手段及教学环节
多媒体教室，大课讲授。
（1）了解细胞分化的主要机制。
（2）理解包括细胞不对称分裂、相关信号转导以及细胞行为。
（3）掌握细胞全能性、细胞分化的机理、成体中的细胞分化、再生。
（一）影响细胞分化的主要因素有哪些？
（二）如何理解细胞全能性、成体中的细胞分化、再生。
（三）细胞分化的实质是什么。
（四）名词解释：细胞分化；转分化；脱分化；细胞的全能性。
（五）癌细胞的主要特征有哪些？
（六）主要的致癌因素有哪些？
主要知识单元13: 第十三章 细胞的衰老与凋亡
（一）体外培养细胞的衰老与Hayflick界限
理解细胞的衰老与Hayflick界限。
（二）细胞衰老的特征
掌握细胞衰老的特征。
（三）细胞衰老的原因与假说
了解主要几个细胞衰老的原因与假说。
掌握细胞凋亡、细胞坏死、细胞程序性死亡的概念。
细胞衰老的特征、细胞衰老的分子机理；细胞死亡的方式、细胞凋亡相关基因。细胞凋亡、细胞坏死、细胞程序性死亡的概念。
细胞衰老的特征、细胞衰老的分子机理；细胞死亡的方式、细胞凋亡相关基因。
（一）了解体外培养细胞的衰老与Hayflick界限。
（二）理解细胞衰老的原因与假说。
（三）掌握细胞衰老的特征，细胞凋亡的概念。
（一）Hayflick界限的内容和意义。
（二）细胞衰老的特征。
（三）细胞凋亡、细胞坏死、细胞程序性死亡的概念。
主要知识单元14: 第十四章 细胞的社会联系
（一）蛋白聚糖
了解蛋白聚糖的种类，掌握蛋白聚糖的生物学作用。
（二）氨基聚糖
了解氨基聚糖的种类，掌握氨基聚糖的生物学作用。
（一）钙粘素和选择素
了解细胞粘着因子的种类，理解并掌握钙粘素、选择素的结构和主要功能。
（二）免疫球蛋白超家族、整合素、透明质酸粘素
了解细胞粘着因子的种类，理解并掌握免疫球蛋白超家族、整合素、透明质酸粘素的结构和主要功能。
（一）动物细胞连接
了解动物细胞连接的种类。理解细胞连接的概念。掌握细胞连接的超微结构及功能。
（二）植物细胞连接
了解植物细胞连接的种类。理解细胞连接的概念。掌握细胞连接的超微结构及功能。
细胞外基质的大分子，包括胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、弹性蛋白的结构及生物学作用。钙粘素、选择素、免疫球蛋白超家族、整合素、透明质酸粘素的结构和主要功能。细胞连接的超微结构及功能。
细胞连接的超微结构及功能。
（一）了解钙粘素、选择素、免疫球蛋白超家族、整合素、透明质酸粘素的结构和主要功能、细胞粘着因子的种类。
（二）理解细胞外基质主要大分子的结构及生物学作用。
（三）掌握细胞连接的种类；细胞连接的概念；细胞连接的超微结构及功能。
（一）简述细胞外大分子的主要结构及生物学功能。
（二）简述钙粘素、选择素、免疫球蛋白超家族、整合素、透明质酸粘素的结构和主要功能。
（三）名词解释：细胞连接；连接子；胞间连丝；紧密连接。
（四）简述各种细胞连接的结构特点和功能。
四、实验实习实训等教学环节
（一）实验条件
表2 实验主要设备和台件数
序号
实验项目
主要设备名称
每组应配台件数
备注
实验一光学显微镜的种类、构造及普通光学显微镜的使用
显微镜
1台／2-3人
实验二细胞形态大小观察
实验三观察胞间连丝的形态
实验四液泡系、线粒体的活体染色
实验五叶绿体的分离与观察
显微镜、离心机
1台显微镜／2-3人
离心机共2台
实验六掌握植物细胞骨架（微丝）的观察方法
实验七细胞活力的测定
荧光显微镜
离心机1台
实验八荧光的细胞化学测定
荧光显微镜1台
实验九逆境胁迫导致的细胞凋亡与检测
实验十细胞的凝集反应
实验十一染色体提前凝集标本制备实验
（选做）
实验十二APK信号通路与乳腺癌细胞增殖及可能机制的探索性实验
实验十三小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察
实验十四免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原
（二）实验项目
表3 实验项目、内容及要求
实验内容
教学目标
观察普通光学显微镜的基本构造
学习显微镜的使用方法
1、了解几种光学显微镜的构造及原理。
2、熟悉普通光学显微镜的主要结构和基本性能。
3、掌握低倍镜、高倍镜和油镜的正确使用方法。
4、初步了解光学显微镜的维护方法。
1、测量洋葱内表皮细胞的大小。
2、观察一些永久切片标本。
学会使用显微镜，并学习测微尺的使用。
红辣椒胞间连丝的制备
观察植物细胞间的胞间连丝，认识细胞不是“独立王国”，每个细胞与其周围细胞有千丝万缕联系。
豆芽根尖液泡系的制备、洋葱内表皮线粒体的制备、小鼠肝脏线粒体的制备
学习活体染色的方法和原理。学会使用油镜。学会实验室处死实验小鼠的方法。
新鲜菠菜叶绿体的制备
1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解差速离心分离细胞器的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体的形态。
洋葱内表皮微丝的制备
光镜下观察细胞骨架
口腔上皮细胞吖啶橙染色、鼠肝细胞的苯胺黑染色
学习鉴别细胞活力的方法。
洋葱内表皮吖啶橙染色、异硫氰酯荧光素染色、罗丹明染色
了解荧光显微技术的原理和方法，以及在细胞化学方面的应用。
洋葱鳞茎内表皮坏死和凋亡处理
1.了解细胞凋亡的原理和形态特征
2.掌握细胞凋亡的形态学观察方法
兔耳缘静脉取血；
黄豆和土豆凝集素制备；细胞凝集反应
1、了解细胞质膜分子组成的生化特征。
2、了解植物凝集素的生化特征。
3、掌握细胞凝集的原理。
收集培养的M期Hela细胞；进行细胞融合，
制备PCC标本
1、了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。
检测ERK1/2对乳腺癌细胞生长的影响
检测乳腺癌细胞中ERK1/2激酶活性以及细胞周期素（推测主要为cyclinD1）与c-myc基因的表达情况，
ERK1/2激酶在细胞内的定位
1、探讨乳腺癌细胞中MAPK信号转导通路异常激活与乳腺癌细胞增殖的关系及可能机制。
2、掌握westernblot实验的原理及操作过程。
3、掌握检测细胞生长情况的三种不同方法
给小白鼠腹腔注射6％淀粉肉汤液，
抽取已处理小鼠腹腔液制片观察
1、通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义。
2、掌握小白鼠腹腔注射给药和颈椎脱臼处死方法。
培养结肠癌细胞并固定制片，
加入小鼠抗体，
加入荧光标记羊抗鼠二次抗体
制片观察
了解特异性免疫荧光抗体反应的一般过程及其在细胞学研究中的应用
（三）实验报告
一.实验目的
1.了解几种光学显微镜的构造及原理。
2.熟悉普通光学显微镜的主要结构和基本性能。
3.掌握低倍镜、高倍镜和油镜的正确使用方法。
4.初步了解光学显微镜的维护方法。
二．实验原理
细胞的发现与光学显微镜（light microscope）的发明分不开。显微镜是在人们认识到凸透镜放大作用的基础上发明的。据历史记载，12世纪阿拉伯人阿尔海琴已会磨制透镜。最早的显微镜是荷兰眼睛商Janssen(1588-1628)于1604年制造的。半个多世纪后，英国物理学家Hooke(1663-1703)创制了第1架具有科学研究价值的显微镜，他首次观察了木栓的显微图像，发现了细胞。真正观察到活细胞的是荷兰科学家Leeuwenhoek(1632-1723)，他用自制的显微镜观察到了池塘水中的原生动物、人和哺乳动物的精子和细菌等，为光学显微镜的发展作出了重大贡献。此后，光学显微镜的研究和制造技术发展很快，适用于各种用途的光学显微镜被制造出来。
随着现在科学技术的发展，显微镜的种类越来越多，性能更加完善，使用范围也越来越广泛。了解各种普通光学显微镜及其结构、原理和操作方法，具有重要的作用和意义。国外一些大的生产光学显微镜的厂家有日本的Olympus、Nikon，德国的Zeiss、Leica；国内的重庆光学仪器厂等厂家生产的组合式显微镜具有多种功能。下面就这几种常用显微镜的光路和用途简要说明。
1. 普通光学显微镜
普通光学显微镜(microscope)是最通用的一种光学显微镜。利用光线照明，标本中各点依其光吸收(即光的振幅发生变化)的不同而在明亮的背景中成像。它由物镜、目镜、聚光镜、光源、载物台和支架等部件组成。其中聚光镜用于调节显微镜的照明，物镜和目镜是放大微小物体成像的主要部件。其基本成像原理是：目镜、物镜、聚光器各自相当于一个凸透镜，被检标本置于聚光器与物镜之间，物镜可使标本在物镜的上方而形成一个倒立的放大实像(倒像)。目镜将此倒像进一步放大成像于人眼的视网膜上，形成一个直立的实像(正像)。显微镜中放大的倒立的虚像与视网膜上直立的实像是相吻合的，该虚像看起来好像在离眼睛250mm处(图1-1)。
2. 暗视野显微镜(dark field microscope)
暗视野显微镜是为了提高反差设计的一种光学显微镜，在组合式显微镜中装入暗视野聚光镜就成为暗视野显微镜。
暗视野显微镜的照明光路如图1-2所示，不像明视野显微镜中的聚光镜那样，照明光线可直接进入聚光镜，再进人物镜而成像；暗视野聚光镜的作用是遮拦掉中间的大部分照明光线，使照明光线形成一个空心光锥，以倾斜的光线照射到标本上。因此标本的像主要是由
标本散射的光线形成，而标本周围的背景由于不能散射光线，因此看上去暗视野显微镜形成的像，背景是黑暗的，标本是亮的，好像是黑夜中的星空。由于暗视野显微镜增大了反差，所以适合于观察单细胞有机体、硅藻、细菌、细胞中的线状结构如鞭毛和纤维等，常用于微生物和胶体化学的研究。暗视野显微镜不适合观察染色的标本，因为染色后，减少了标本和周围介质之间折射率的差别，使暗视野的影像质量变差。
暗视野聚光镜有抛物面型(N.A．值较低)和心型(N.A．值较高，油浸)2种。使用时应注意暗视野聚光镜的N.A．值要大于所用物镜的N.A．值，防止直射光进入物镜。
3. 相差显微镜(phase contrast microscope)
人的眼睛只能鉴别可见光波长(颜色)和振幅(强度)的变化，不能鉴别相位的变化。但是大多数活的生物样品高度透明，光波通过后振幅基本不变，却存在相位的变化，只是人的眼睛感觉不到。Zernike设计的相差显微镜，能将人眼看不见的样品本身的相位差(或光程差)转变为人眼能看见的振幅(光强度)变化。
从相差显微镜示意图1-3中可以看出，从结构上看相差显微镜与一般显微镜不同之处在于：相差显微镜的聚光镜具有环状光阑，物镜的后焦面处装有相位板。
相差显微镜的基本原理是：光线通过标本后，产生直射光线和衍射光线，直射光线和衍射光线干涉后将在像平面上成像。对于已染色的标本而言，由于标本各点吸收光不同，直射光线和衍射光线在像平面上干涉后成为一个眼睛可以感知的亮度(振幅)有变化的像；如果光线通过的是活细胞，亮度或振幅的变化没有或很小，但直射光线超前于衍射光线1/4波长，二者干涉后人眼感觉不到。为了人眼能感知，相差显微镜进行了巧妙的光学设计：在物镜后焦面处设有环形的相位板，在聚光镜上设有环状光阑，并且设计环状光阑的像恰好在物镜后焦面上。由于相位板材料的光学特性和厚度可人为控制，可使通过它的直射光线超前或滞后衍射光线1/4波长。如果使用令直射光线超前1/4波长的相位板，直射光就较衍射光共超前1/2波长，直射光和衍射光干涉后，光波振幅减弱，造成像暗背景亮，称为正相差；反之，如果使用令直射光线滞后1/4波长的相位板，直射光将与衍射光同相位，直射光和衍射光干涉后，光波振幅增强，造成像亮背景暗，称为负相差。因此，相差显微镜实现了从相位差(或光程差)向振幅差(光强度差)的转变。为了确保直射光线通过相位板，使用时必须先摘下一个目镜，插入一个聚焦望远镜，观察物镜后焦面上环状光阑和相位板的像，一边观察，一边用聚光镜调中螺旋调节环状光阑的位置，当调节到环状光阑的亮光环与相位板的环吻合时，说明直射光线通过了相位板，相位被改变1/4波长，这时，就可在目镜中观察到一个质量很好的相差显微镜像。相差显微镜可用于观察活细胞、未染色的组织切片或缺少反差的染色标本。由于操作简便，所以成为生物学和医学中最常用的观察显微镜。
相差显微镜是在光学显微镜发展史上的一项创新技术。19世纪30年代荷兰物理学家Zernike首先设计、并于1942年制造了第1台相差显微镜，由于此项发明，Zernike于1953年获诺贝尔奖。
4. 微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)
微分干涉差显微镜与相差显微镜一样，也是能将人眼看不见的物体本身的相位差(或光程差)转变为人眼能看见的振幅(光强度)变化的显微镜。不同之处是相差显微镜是根据通过物体的直射光线和衍射光线之间的相位差设计的；而微分干涉差显微镜是一种特殊形式的干涉显微镜，它是根据通过物体内只分开1μm或者更短距离的2束相干光之间的相位差设计的，使标本内邻近2点的光程差被显微镜中特殊的光学系统转变为振幅(光强度)的变化，从而可观察到标本内细微的结构，所以称为微分干涉差显微镜。根据照明方式，微分干涉差显微镜分为落射式和透射式2种，生物学和医学观察中多采用图1-4所示的透射式微分干涉差显微镜。
从微分干涉差显微镜的示意图可以看出，微分干涉差显微镜包含2块正交的偏光镜：一块靠近光源，称为起偏镜；另一块靠近目镜，称为检偏镜。在起偏镜和聚光镜之间放置第1块渥氏(Wollaston)棱镜，在物镜和检偏镜之间放置第2块渥氏棱镜，这就是微分干涉差显微镜的基本结构。其基本原理是：来自光源的自然光经起偏镜后成为线偏振光，以45º方位角(入射光偏振方向与晶体光轴之间的夹角)垂直入射到第1渥氏镜，这时入射偏光分解为振动方向互相垂直、传播方向一致的O光和E光，穿过第1渥氏镜的中心点后，由于晶体光轴方向的改变，O光和E光从中心点发散开一个很小的角度，经过聚光镜后产生出间隔只有1μm甚至间隔更短些的平行光束，穿过标本的2个点。由于光线通过标本2个点的光程长不同，2束光线的相位都发生了变化，带有标本2个近邻点相位差信息的这2束线偏振光通过物镜后，会聚在第2渥氏镜的中心点，组合在一起的这2束线偏振光相位差不同，偏振方向互相垂直，不能直接干涉成像。当它们通过检偏镜后成为振动面相同、频率相同且具有一定相位差的相干光束，因而在中间像平面上形成干涉的物像。
实际使用时要注意：j载玻片的厚度标准是1 mm；盖玻片的厚度标准是0.17mm；载玻片和盖玻片一定要清洁。k微分干涉差显微镜在检测灵敏度上有方向性(相差显微镜无方向性)，应使用旋转载物台。ƒ一般第1棱镜与聚光镜相连，第2棱镜与物镜相连，所以要匹配所使用的聚光镜和物镜。m根据各厂家的具体操作步骤依序进行操作：调焦标本，调节柯勒照明，调节起偏镜和检偏镜成为正交位置，调节与标本相应的理想干涉色，使形成很好的微分干涉差影像。
1955年法国物理学家Nomarski用诺氏棱镜取代了渥氏棱镜，经他这样改进后，能够制造出适合于不同放大倍数物镜观察的微分干涉差显微镜，称为诺曼尔斯基式微分干涉差显微镜。微分干涉差显微镜可以观察活的或未染色标本的精细结构，影像具有浮雕感，若以白光照明可以产生彩色影像，称为光染色。此外，这种显微镜操作也很方便，所以得到了广泛的应用。
5. 荧光显微镜(fluorescence microscope)
荧光显微镜是利用较短波长的光使样品受到激发，产生较长波长的荧光，可用来观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置。
任何一种荧光物质都有其特有的吸收光谱和荧光发射光谱，荧光发射光谱比吸收光谱的波长偏长波方向，但二者有部分重叠，例如标记细胞内总蛋白的异硫氰基荧光素(FITC)的吸收光谱和发射光谱，如图1-5所示。所以，荧光显微镜的光路设计必须分离开激发光和荧光，使观察者能够看到纯的荧光。
根据激发光照明方式的不同，荧光显微镜可分为透射式和落射式2种，生物学和医学观察中多用落射式荧光显微镜，其光路如图1-6所示。
从荧光显微镜光路图中可知，落射式荧光显微镜主要包括光源、激发滤片、双色反射镜、阻断滤片、物镜和目镜等几部分，它们在光路中的作用分述如下：
(1)光源：高压汞灯或氙灯是常用的荧光激发光源。汞灯在366nm、405 nm、436nm、546nm、577nm处有很强的发射线，氙灯也在光的紫外区、可见区有较强的发射线。
(2)激发滤片：放置于光源和物镜之间，其作用是选择适宜于激发欲观察荧光物质的波长范围。
(3)双色反射镜：它的放置方向与激发光的方向呈45º，具有一个特征波长值M。波长长于M的光波被透射，波长短于M的光波被反射。因此它是初步分离开激发光(较短波长)和发射荧光(较长波长)的一个重要组件。
(4)阻断滤片：采用长波通滤片，即能使长于某波长的光通过，短于某波长的光不能通过。阻断滤片的作用是进一步使荧光与激发光分离，以获得更纯的荧光。内阻断滤片已固定在内部，外阻断滤片可根据需要装入或卸下。
(5)物镜：由于激发标本和收集荧光都是由同一物镜实现的，所以物镜的选择对于荧光观察有重要作用。荧光物镜是能透过紫外光的特制物镜。荧光效率与所用物镜数值孔径的4次方成正比，所以用数值孔径较大的浸液物镜(水浸或油浸)效果较好，一些著名厂家生产了数值孔径为1.30的40×和63×荧光物镜，使用效果很好。
(6)目镜：荧光亮度与目镜放大倍数的平方成反比，如6.3×目镜比10×目镜观察荧光更亮，所以可采用较低倍目镜观察。
从图1-6中可以看出，落射式荧光显微镜的光路为：从高压汞灯或氙灯发射出的激发光经激发滤片后，选择出适宜的激发光到达双色反射镜，经它分光后，较短波长的激发光反射下来，经物镜后激发样品，样品产生的荧光再经物镜后到达双色反射镜，经其分光作用，较长波长的荧光透射过去，经阻断滤片后进一步阻断掉一些短波长的激发光，使纯荧光到达目镜可供观察。对于一种荧光物质，应根据它的吸收光谱和发射光谱选择适宜的激发滤片、双色反射镜和阻断滤片。为了操作方便，并且获得更科学的匹配，荷兰科学家Ploem于20世纪70年代初发明了荧光垂直照明器装置。荧光垂直照明器将激发滤片、双色反射镜和阻断滤片组合成几组，使用十分方便。那时前西德莱茨厂(Leitz，现称Leica公司)以他的名字命名荧光垂直照明器。现在很多著名国内外厂家生产的荧光显微镜都采用了这种装置。
在生物学和医学中主要观察几种类型的荧光：自发荧光、染色荧光、诱发荧光、免疫荧光和酶诱发荧光等，特别是近年来又用于观察荧光标记分子探针。所以包括荧光显微镜在内的荧光的观察、标记和测量技术在生物学和医学研究中获得了极其广泛的应用。
6. 偏光显微镜(polarizing microscope)
偏光显微镜是用于观察双折射样品的显微镜。绝大多数结构规则的生物体系的折射率因光波传播方向而异，一般称为双折射体系。偏光显微镜的主要组成是在一般显微镜的光源和聚光镜之间放置1个起偏(振)镜，在物镜和目镜之间放置1个检偏(振)镜，并采用旋转载物台。调节起、检偏(振)镜的主截面使之互相垂直(正交位置)，聚焦样品后，可在暗背景上显出双折射样品的明亮像。此外，利用各种补色器可以定量测定双折射的程度，进而推算出分子或颗粒在样品中排列的方向。
除上述列举的几种显微镜外，还发展了用远红外线作光源的显微镜，由于波长不受水的于扰，反差也好，不用染色即可观察活体标本。还有利用紫外线做光源的显微镜。另外根据显微镜的不同用途对其结构作适当的改变后，可形成许多其他类型，如比较显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、毛细管显微镜以及离心显微镜等，其中倒置显微镜(inverted microscope)使用广泛。倒置显微镜与正置显微镜的区别在于镜体的光学组件排列对于物台而言是相反的：正置显微镜的聚光镜和光源在物台的下面，而倒置显微镜的聚光镜和光源在物台的上面；正置显微镜的物镜在物台的上面，而倒置显微镜的物镜在物台的下面。由于可以直接将培养细胞的瓶、皿放在倒置显微镜的物台上，所以一般在细胞培养室中放置1台配有相差装置的倒置显微镜，可随时观察细胞的培养情况。近年来还发展了更先进的激光扫描共焦显微镜和多光子激发荧光显微镜。
7. 激光扫描共焦显微镜(1aser scanning confocal microscope，LSCM)
激光扫描共焦显微镜或称共焦扫描激光显微镜是20世纪80年代发展起来的新技术。这种技术不需烦琐的样品处理，而是巧妙地利用共焦光路和激光扫描技术获取生物样品不同层面的图像(称为光切片)，再通过计算机组合成三维重构的影像。
仪器的基本组件和功能如图1-7所示：高数值孔径的物镜、扫描器(其作用是驱使激光在样品焦平面上进行前后移动)、双色反射镜(使较长波长的光透过它，使较短波长的光反射到扫描器，作用是分离激发光和荧光)、1个简单的消色差棱镜、针孔光阑和1个检测器(光电倍增管或者二极管矩阵)，针孔光阑的中心孔点和激光经物镜在样品平面上的聚焦点在光学上是共轭的，即标本上某点的像呈现在针孔光阑处。
具体光路为：高能激光被1个双色反射镜反射后，进入1个扫描装置(是1个振动的反射镜或者是1个振动的晶体)，它以光栅扫描的方式在样品的X—Y平面上扫描，扫描光线再通过1个高数值孔径的物镜，聚焦在1个样品点上，这是共焦显微镜的第1个焦点。由于使用1个高数值孔径的物镜，光以1个很大的角度到达样品，产生了1个很薄的焦面。激光在1个样品平面上扫描后，继而在Z轴方向移动1μm (可调节距离)，再进行X—Y平面上的扫描，可将每一X—Y平面上的扫描看成1个光切片，将很多光切片集合起来，就可产生出1个三维物体的结构。激光激发样品发射出的荧光返回到物镜、扫描器和双色反射镜，到达1个消色差棱镜，由它聚焦到1个针孔光阑，这是共焦显微镜的第2个焦点，最后穿过针孔光阑的光被1个检测器收集，信号被处理后，形成1个扫描区的图像。计算机控制了所有的机械、电子操作以及图像的储存和处理。
由于针孔光阑起到空间滤波的作用，使样品焦面之上和之下发出的杂散光都被针孔光阑阻拦，所以分辨力可提高到30nm，比一般显微镜分辨力的200nm提高约7倍。可用于观察复杂生物样品的三维结构，如细胞质中的细胞骨架网络、细胞核中染色体等。
8. 多光子荧光显微镜(multiphoton fluorescence microscopy，MFM)
普通的荧光显微镜都是用单光子激发(如用360nm的紫外光激发样品)，而多光子荧光显微镜是用双光子或多光子同时激发样品(如用2个波长为1 000nm的光子同时激发)使样品产生荧光。多光子荧光显微镜也称为多光子激发(multiphoton excitation，MPE)荧光显微镜。
其基本原理是：荧光物质的1个分子几乎同时吸收2个同一频率的光子(如果是双光子,ω1=ω2，分子被激发至高能级，随即发生自发跃迁，辐射出一频率略小于2倍入射光频率的荧光分子(图1-8)。
多光子荧光显微镜的构造与激光共焦扫描显微镜类似，由于不需要空间滤波，因此比激光扫描共焦显微镜减少了1个针孔光阑。与普通荧光显微镜和激光共焦显微镜相比较，多光子荧光显微镜成像有2个主要特点，这2个特点给生物学和医学样品的观察带来很多优越性，简介如下：
第1个特点是：多光子激发光的使用频率低于单光子激发光的频率。这样在单光子激发时需要紫外光激发的染料，在多光子激发的情况下，只需红光、近红外光或是红外光的激发就可以了。其优越性在于：j由于红光、近红外光或是红外光的能量较低，减少了高能量的单光子紫外激发对生物样品的光分解作用，有利于更长时间地观察活细胞或活生物样品。k由于激发样品时产生的散射光与波长的4次方成反比，所以与普通荧光显微镜和激光共焦显微镜相比较，多光子激发造成的散射光要小得多，大大降低了散射光对测量的干扰，使激发光能大部分能到达样品焦平面，提高了穿透深度，而且还会使焦点处的激发光强增大，提高荧光光强。这在高散射活体测量时尤为重要。ƒ多光子激发比单光子激发提高信噪比。第2个特点是：N光子的激发几率与激发光强的N次方成正比(即发射荧光光强与激发光强的N次方成正比)。因此多光子激发过程只在焦点附近(焦点附近激光强，多光子同时被吸收)会大量激发染料，远离焦点的荧光光强会迅速降低，所以多光子技术可以避免过早地漂白非焦点区域的染料，从而可延长检测时间，有利于减少测量误差。
多光子荧光显微镜与激光共焦扫描显微镜相比较，虽然多光子荧光显微镜价格昂贵，但由于它的激发光波长长，对活细胞损伤小，光散射低、光漂白少，信噪比大，省去了针孔光阑的空间滤波，所以多光子激发荧光成像技术也逐渐被应用于生物学和医学研究领域，并发挥了显著作用。
三．实验用品
普通光学显微镜、擦镜纸、动植物组织细胞装片、香柏油、二甲苯。
四．实验步骤
(一)普通光学显微镜的基本构造
光学显微镜主要由三部分组成：机械部分、光学部分和照明部分(图1-9)。
1.机械部分
(1)镜座(base)：是显微镜的基座，起稳定和支持整个镜身的作用。有的显微镜在镜座内装有照明光源等构造。
(2)镜柱(pillar)：连接镜座和镜臂的短柱。
(3)镜臂(arm)：是支持镜筒和镜台的在镜柱上方弯曲的部分，拿镜时手握此臂，方便搬动。镜筒直立式光镜在镜臂和镜柱之间有一可活动的关节叫倾斜关节，可使镜臂做适当倾斜，便于观察。使用时倾斜度一般不应超过45°，否则光镜重心偏移而容易翻倒。镜筒倾斜式显微镜由于镜臂和镜柱连为一体，故无此关节。
(4)镜筒(1ight tube)：位于镜臂前方的圆筒状结构，上端安装目镜，下端与物镜转换器相连。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式两类(图1-9)，单筒式又分直立式和倾斜式两种，而双筒式的镜筒均为倾斜的。
(5)转换器(revolving nosepiece)：圆盘状，在镜筒下方，其上装有3～4个放大倍数不同的物镜，可以按顺时针或逆时针方向自由旋转。转换器的内缘有一“T”形卡，用于对准和固定物镜位置，转动旋转盘可使不同的物镜到达工作位置，使物镜和光轴同心(合轴)。
(6)载物台(stage)：又称平台，位于镜筒的下方，方形或圆形，放置玻片标本用。载物台的中央有一圆形通光孔，两旁各有一压片夹。有的载物台上装有标本移动器，移动器上装有弹簧夹，用于固定标本片。移动器的一侧有两个旋钮，转动旋钮可使玻片前后左右移动，以方便寻找观察目标。在移动器上还附有一纵横游标尺，用于计算标本移动的距离和确定标本的位置。
(7)调节器(regulator)：位于镜臂的上端或下端，有一对大小旋钮，为调节焦距之用。大旋钮为粗调节器，转动粗调节钮可使镜筒(或载物台)升降，调节焦距。旋转一周可使镜筒(或载物台)升降l0mm。一般用于低倍镜调焦。小旋钮为细调节器，转动细调节钮可使镜筒(或载物台)缓慢升降，每旋转一周约使镜筒(或载物台)升降0.1mm。适用于高倍镜、油镜或分辨物像清晰度调焦。
2.照明部分
(1)反光镜(reflecting mirror)：位于载物台下方，镜柱前面的一个圆镜。镜的一面为平面，另一面为凹面。平面镜聚光力弱，适于强光源和平行光源。凹面镜聚光力强，适用于弱光源或散射光源。反光镜的方位可以随意调节。较新的双筒光镜光源通常装在光镜的镜座内，通过按钮控制开关，镜座侧面有一滑动键或旋钮，可调节光线强弱。
(2)聚光器(condensor)：在载物台下方，由一组透镜组成，可使反射光线聚集于标本上。一般在镜柱一侧有一旋钮，可使聚光器升降，与物镜配合使用。
(3)光圈(aperture)：在集光器下方，由一组活动金属片组成，构成一个可开可缩的孔。在其外侧有一小柄，可以调节控制光线通过。在光圈的下方常装有滤光片架，可以放置不同颜色的滤光片。
3.光学部分
(1)目镜(eyepiece)：又称接目镜，短圆筒状，装在镜筒上端，在目镜的侧面刻有放大倍数，每台显微镜常备有3～4只放大倍数不同的目镜，如5×、10×、15×等，在使用时，可根据不同的需要选择倍数的大小，最常用的是10×目镜。通过目镜就能观察到被放大的物像。
表1-1 标准物镜的性质比较
放大倍数
镜口率(N.A．)
分辨力/μm
工作距离/mm
0.28
1.00
6.50
40
0.65
0.42
0.60
100
1.30
0.21
0.20
(2)物镜(objective)：装在物镜转换器上的一组镜头，一般有低倍镜、高倍镜、油镜三种。每个物镜上刻有相应的标记，低倍镜筒上刻有10×或15×等标志，高倍镜筒上刻有40×或45×标志，油镜上一般为100×。N.A．表示镜口率，镜口率反映镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨力越高。各种物镜的性质见表1-1。
(二)普通显微镜的性能和质量
光学显微镜的性能和质量的高低可受分辨率、放大率、镜口率、焦点深度和视场宽度等的影响，这些指标都有一定限度，彼此间相互作用又相互制约，若改善或提高某方面的性能，都会使另一性能降低。
1.分辨力
分辨力(resolving power)又称分辨率或分辨本领，指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地把两个被检细微物点分开的最小距离的能力。这两点之间的距离即为其分辨力，这个距离越近，其分辨力越高。据测定，人眼的分辨力约为l00μm，而光学显微镜的分辨力可达0.2μm。显微镜的分辨力依下列公式来计算：
R=0.61λ/N.A． (N.A．=n·sinθ)
式中，R为分辨力；λ为照明光源的波长，白光约为0.5μm；N.A．为镜口率；
n为介质的折射率，n的最大值为1.5；sinθ为透镜视锥半顶角的正弦。
2.放大率
放大率是光学显微镜的另一个重要参数，光镜放大倍数的计算公式如下：
实物放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数
光学显微镜常用的最大放大倍数一般为1600倍。物镜放大率是对一定镜筒长度而言的，镜筒长度变化后，不仅放大率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此使用显微镜时，不能任意改变镜筒的长度。一般国际上将光学显微镜的标准镜筒长度定为160mm，并标刻在物镜的外壳上。
3.焦点深度
当把焦点对准某一物点时，不仅位于该点平面上的各点都可看得清楚，而且在平面的上下一定厚度内也能看得清楚，这个清晰部分的厚度就是焦点深度。焦深与总放大率和镜口率成反比，因此高放大率和高镜口率显微镜的焦深就浅，不能看到标本的全厚度，必须调节螺旋改变焦距，并仔细地从上到下进行观察。
4.视场亮度
视场亮度是指光学显微镜的整个视场的明暗程度。在使用光镜时，不更换物镜和目镜的情况下，视场亮度大，观察到的图像也就大。
(三)显微镜的使用方法
1.用前的准备工作
(1)打开镜箱，右手握住镜臂，左手托住镜座，小心地把显微镜从镜箱内取出，轻轻地放在实验桌上。
(2)检查显微镜的各部件是否完整和正常，如发现有部件损坏或出现故障，应立即停止使用，待排除故障或修复后，才能继续操作。
2.低倍镜的使用
(1)准备：将显微镜放于前方略偏左侧，必要时使镜筒倾斜(有的显微镜本身已经倾斜)以便观察。转动粗调节钮，将镜筒略升高(或将载物台下降)使物镜与载物台距离拉开，以免物镜与载物台相碰。然后旋转物镜转换器，将低倍镜对准载物台中央的通光孔(可听到“咔哒”声)。
(2)对光：打开光圈，上升聚光器，双眼同时睁开，以左眼向目镜内观察，双手并用，左手调焦，右手移片或绘图记录，同时调节反光镜的方向，使视野内的光线均匀，亮度适中。
(3)放标本片：标本片的盖片朝上，将标本片放到载物台前方，然后推到物镜下面，用压片夹压住，如有标本移动器，可用上面的弹簧夹夹住标本片，然后把要观察的部分移到通光孔的正中央。
(4)调节焦距：从显微镜侧面注视物镜镜头，同时旋转粗调节钮，使镜筒缓慢下降(或镜台上升)，低倍镜的镜头端与玻片间的距离约5mm时，再用左眼从目镜里观察视野，左手慢慢转动粗调节钮，使镜筒缓缓上升，直至视野中出现物像。如物像不太清晰，可转动细调节钮，使物像达到最清晰为止。
如果按上述操作步骤仍看不到物像时，可能由以下原因造成：
a.转动调节钮太快，超过焦点，应按上述步骤重新调节焦距。
b.物镜没有对正，应对正后再观察。
c.标本没有放到视野内，应移动标本片寻找观察对象。
d.光线太强，尤其观察比较透明的标本或没有染色的标本时,易出现这种现象，应将光线调暗一些后再观察。
3.高倍镜的使用
(1)依照上述操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。
(2)将需要观察的部分移到视野的中央。
(3)眼睛从侧面注视物镜，用手移动转换器，换高倍镜。
(4)眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动细调节钮，直至视野内看到清晰的物像为止。如按上述操作仍看不到物像时，可能由下列原因造成：
a.观察的部分没在视野内，应在低倍镜下寻找到后，移到视野中央，再换高倍镜观察。
b.标本片放反了，应把标本片放正后，再按上述步骤操作。
c.焦距没调好，应仔细调节焦距。
有的显微镜高倍镜与低倍镜不配套，从低倍镜转换高倍镜时，往往转不过来或撞坏标本，如遇到这种情况，可把镜筒略升高(或载物台下降)，直接用高倍镜调焦方法是：从侧面注视物镜，调节粗调节钮，使高倍镜头下降至与标本片最短距离，再观察目镜视野，慢慢调节细调节钮；使镜头缓缓上升，直至物像清晰为止。如需要更换标本片时，应该先把镜筒升高(或载物台下降)，然后把标本片移到载物台前方，再取下。
4.油镜的使用方法
(1)先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到物像，把要放大观察的部分移到视野中央。
(2)把高倍镜移开，在标本片上滴一滴香柏油，眼睛从侧面注视镜头，轻轻转换油镜，使镜面浸在油滴中。在一般情况下，转过油镜即可看到物像，如不清楚，可来回调动细调节钮，即可看清物像。如仍看不清，应按上述步骤可重复。
(3)找到物像后，再调节聚光器和光圈，选择最适光线。
(4)油镜使用完毕后，把镜头上升约10mm，并转到一边，用擦镜纸把镜头擦净。如仍擦不干净，可用擦镜纸蘸少许擦镜水或二甲苯轻擦，然后再用干净的擦镜纸擦一遍。
(5)有盖片的标本片，可用擦镜纸蘸少许擦镜水或二甲苯，把油擦净。无盖片的标本片，可用拉纸法擦油。方法是：先把一小张擦镜纸盖在油滴上，再滴上二甲苯，平拉擦镜纸，反复几次即可擦净。也可以在二甲苯中把油洗去晾干。
5.使用练习
(1)低倍镜使用练习：取一张A字片，用低倍镜观察。练习对光、调焦，并注意观察物像与玻片移动方向是否一致，镜下观察的字母是正像还是反像?
(2)高倍镜使用练习：取一张羊毛交叉片(染成红色)，先用低倍镜观察，找到羊毛交叉点，移到视野中央，换高倍镜观察。调节焦距，注意观察上下羊毛的清晰度。
(3)油镜使用练习：取一张人血涂片，先用低倍镜、高倍镜观察，再练习用油镜观察。
注意比较三种物镜的放大倍数和分辨率有何不同。练习分辨红细胞、白细胞和淋巴细胞。练习擦洗油镜头和标本片。
(四)使用显微镜的注意事项
1.取显微镜时必须右手握住镜臂，左手托镜座，切勿一手斜提，前后摆动，以防镜头或其他零件跌落。
2.观察标本时，显微镜离实验台边缘应保持一定距离(5cm)，以免显微镜翻倒落地。镜柱与镜臂间的倾斜角度不得超过45°，用完立即还原。
3.使用时要严格按步骤操作，熟悉显微镜各部件性能，掌握粗、细调节钮的转动方向与镜筒升降关系。转动粗调节钮向下时，眼睛必须注视物镜头。
4.观察带有液体的临时标本时要加盖片，不能使用倾斜关节，以免液体污染镜头和显微镜。
5.粗、细调节钮要配合使用，细调节钮不能单方向过度旋转，调节焦距时，要从侧面注视镜筒下降，以免压坏标本和镜头。
6.用单筒显微镜观察标本，应双眼同时睁开，左眼观察物像，右眼用以绘图，左手调节焦距，右手移动标本或绘图。
7.禁止随意拧开或调换目镜、物镜和聚光器等零件。
8.显微镜的光学部件不可用手指、纱布、手帕或其他粗糙东西擦拭，以免磨损镜面。需要时只能用擦镜纸擦拭。
9.凡有腐蚀性和挥发性的化学试剂和药品，如碘、乙醇溶液、酸类、碱类等都不可与显微镜接触，如不慎污染时，应立即擦干净。
10.实验完毕，要将玻片取出，用擦镜纸将镜头擦拭干净后移开，不能与通光孔相对。用绸布包好，放回镜箱。切不可把显微镜放在直射光线下曝晒。
五.实验结果
1.填图注明光学显微镜各部件的结构名称。
2.怎样区分低倍镜、高倍镜和油镜?
3.简述使用低倍镜、高倍镜和油镜的主要步骤。
一、实验目的：
学习测微尺的使用，并测量洋葱内表皮细胞的大小。
二、实验原理：
使用镜台测微尺，目镜测微尺（直线式、网格式）和微调焦轮上的标尺测量细胞的大小。
三、实验用品：
2.5% 番红溶液；洋葱上皮细胞；草履虫、洋葱根尖及其它细胞永久切片。
四.实验步骤：
（一）目微尺的校对：将目微尺放入目镜、台微尺卡在载物台上，调焦，看清台微尺，台微尺和目微尺左、右各选一重合线。并根据下面公式计算：
载玻片大小的台微尺→ 载物台→
→台、目微尺在视野内平行
圆的目微尺→目镜筒(10×,40×,100×)
→台、目微尺各选一重合线，读取这一范围内的格数→目微尺每格大小→
X10、 40、 100 = a an ：台微尺刻度数
m ：目微尺刻度数→移去台微
a ：台微尺实际值（0.01mm）
尺，换上洋葱内表皮标本
（二）观察细胞形态，测量细胞大小：
1、观察洋葱表皮cell（取其内表皮放在载玻片上，加番红染5分钟封片观察）
（1）测量细胞横截面面积
撕取洋葱内表皮0.3×0.3cm → 放于载玻片→ 番红染液染色5min → 加盖玻片（用滤纸条吸去多余的液体）→ 10×物镜下观察→ 粗调焦轮找到细胞→ 微调焦轮调节清晰，看到细胞 → 旋转目镜将标尺与细胞长边平行，并记录格数a → 旋转目镜将标尺与细胞宽边平行，记录格数b → 细胞截面面积=ax×bx（x实际数值前面已经校对）
（2）测量细胞厚度：
调节微调焦轮→ 两细胞之间变成细，黄亮色线，细胞表面柱状杂质（上表皮）→ 记录微调焦论刻度
调节微调焦轮 → 两细胞之间黄亮线逐渐变粗，变黑，变成黑色细线，细胞表面杂质（下表皮）→ 记录微调焦轮刻度→ 两次记录之间焦轮刻度数c → 细胞厚度=c×2μm（微调焦轮刻度数2μm/格）
（3）测量细胞核体积
调节微调焦轮→ 细胞核清晰→ 调节目微尺测量细胞核→ 根据球的体积→计算细胞核的体积Vn
2、计算细胞体积，求Np
V长方体=a·b·c V椭圆形= 4πab2/3 (a→长半径b→短半径c→细胞高)
V球=4πR3/3 V圆柱形=πr2h (r→半径 h→高)
3、其它细胞永久片的观察。
五.实验结果：
1、求洋葱细胞的NP。
2、画出洋葱表皮细胞。
3、其它细胞永久片的细胞形态图。
一、实验目的
二、实验原理
除极少数特化的细胞外，高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接，完成细胞间的通讯联络。
三、实验材料
红辣椒。
四、实验步骤：
红辣椒表皮细胞临时制片：剪取一小块红辣椒→放在载玻片上→用手按住一边→用刀片小心刮去果肉→留下一层极薄（几乎透明）的表皮→用刀片切下刮去果肉的表皮（大小约0.3cm×0.3cm）→置于一干净载玻片上→加水一滴→盖片→用滤纸条吸去多余的水→观察（10×，40×）
画出胞间连丝图，说明胞间连丝作用。
一．实验目的及意义：
学习活体染色的方法和原理。
二．实验原理：
1、活体染色；用某些无毒或毒性较小的染色剂显示出细胞内某些天然构造的真实性，而不影响细胞的生命活力，也不产生任何的物理、化学变化引起细胞死亡，这种染色方法叫活体染色。
2、液泡系、线粒体是细胞内重要的细胞器，它们通过特殊的活体染色剂染色，可显示出生活状态下的形态结构。
3、染料：
酸性：带负电荷，易在细胞质中产生沉淀。（种类很少）
碱性；带正电荷，被普遍采用。
①中性红染液：是液泡系特殊的活体染色剂，可将不同发育时期的液泡染成不同深度的红色，而细胞质、细胞核不被染色。（黄豆芽）②Janus Green B 染液：是对线粒体具有专一性的染料，具脂溶性，解离后，有染色能力的基团带正电，结合在带负电的线粒体内膜上。由于线粒体内膜上细胞色素氧化酶系的作用，使染料保持氧化状态而显蓝绿色其它部分不染色。
三．实验步骤：
1：液泡系的观察：
取豆芽根尖1—2cm →用双面刀→先纵切一小部分→再沿切面→长纵切根尖→切下极薄一片，尽量是一层细胞→放在载玻片上→滴中性红溶液→染色10-15分钟→吸水纸吸去染液→滴加蒸馏水→加盖玻片→吸水纸吸去多余的水份→观察液泡大小及颜色变化（10×，40×）→在分生组织区细胞没有液泡，随着细胞的生长成熟，较大细胞中液泡小而圆、染色浓、数量多个，而成熟细胞中液泡发展成为一个中央大液泡、颜色浅，表现为几乎整个细胞被染色。
2：线粒体分布的观察
（1）植物细胞中线粒体分布：
用镊子撕洋葱内表皮（0.3×0.3cm）→置于载玻片上→滴一滴Janus Green B→染色30分钟→滴加蒸馏水→吸水纸吸干→盖片观察→10×观察→40×观察→载玻片上滴加松柏油100×观察。
（2）动物细胞中线粒体分布，取小鼠肝脏→放在表面皿→用Ringer 液冲洗多次,冲洗掉血水→用镊子分成4份，分别放在4个表面皿里→继续将分到的肝脏用Ringer 液冲洗多次,冲洗掉血水→用滤纸条吸去多余的液体→用镊子撕成小块（约大米粒大小）（撕扯中有单个细胞掉下来）→用Janus Green B染色,染液不能完全浸没→染色30分钟,不停翻动组织块，以利于呼吸→及时补充表面皿里的水份，防止水份蒸发导致细胞悬液过浓。用吸管吸组织液（染色液）观察→加盖玻片时（加2根头发）→10×观察→40×观察→在载玻片上滴加松柏油，100×观察（观察后用镜头纸沾二甲苯擦掉镜头及玻片上的松柏油）→
四．作业：
1、绘图豆芽根尖液泡系的分布（100×）。
2、绘图洋葱线粒体的分布（100×）。3、绘图鼠肝细胞线粒体的分布（100×）。
一．实验目的
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol／L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1 000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3 000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
1、器材
主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
小型器材：烧杯2个，10ml量筒，滴管，离心管，纱布若干，载片及盖片。
2、材料：新鲜菠菜。
3、试剂：0.35mol/L NaCl溶液。
四．实验方法
1、叶绿体的分离与观察
（1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称6g于研钵中，加10ml 0.35mol/L NaCl溶液，用研钵捣碎成匀浆状。
(2)将匀浆用4层纱布过滤于50ml烧杯中。
(3)取滤液4ml于离心管中，在1000r/min下离心2min（注意离心前用天平配平）。
(4)将上清液倒入另一个干净的离心管中。
(5)将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(可能混有部分细胞核)，
(6)将沉淀用2 ml 0.35mol/L NaCl溶液悬浮（用滴管吹打沉淀使之悬浮）。
(7)用滴管取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后（用滤纸吸掉多余的液体）即可在普通光镜下观察（10×，40×，100×）。
(8)叶绿体悬液如果过浓，用0.35mol/L NaCl溶液稀释后重新制片观察。
2、菠菜叶切片观察
用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／L NaCl溶液，盖片后轻压，置普通显微镜下观察。
五．实验结果
1、画出高倍镜下的叶绿体图（多角度）；
2、说明0.35mol/LNaCl溶液的作用，是否可以蒸馏水代替。
一．实验目的：
光镜下观察细胞骨架。
1、原理：在一定时间内，用适当浓度的TritonX-100(曲拉通X-100)处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮蓝R250染色，可在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。
2、细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。在细胞中支持和连接细胞各组份，与细胞运动有关的结构，包括微丝（MF）、微管（MT）、中间纤维。
3、TritonX-100：非离子型去垢剂，在一定时间内可消除细胞骨架外部杂蛋白，而骨架蛋白得以保留但长时间作用，也会破坏骨架蛋白。
4、M-缓冲液：增加膜稳定性，冲洗TritonX-100。
5、戊二醛：固定剂，使骨架蛋白变性，但网络形态不变。
6、考马斯亮兰R250：蛋白质染色剂（无选择特异性）。
三、试剂材料：M-缓冲液6mMol/L pH6.8；1% Triton X-100溶液； 2.5%戊二醛；0.2%的考马斯亮兰R250；PBS溶液；洋葱。
四．实验方法：
1.撕洋葱内表皮，置PBS液中，使之沉降3-4小时；
2.用镊子取几片处理好的洋葱内表皮，置于表面皿中；
3.用滤纸吸去PBS液，加入1%Triton x-100浸没，经常翻动洋葱内表皮。（处理时间15，17，19，21，23分钟）处理时每人选一个时间，处理结束后倒掉1%Triton x-100，用滤纸吸去多余液体。
4.加入适量的（达到完全浸泡）M-缓冲液，浸泡3-5分钟，倒掉液体。重复3次；
5.用滤纸吸去多余液体；
6.加入2.5%戊二醛浸泡0.5小时（轻轻翻动2次）；
7.倒掉液体。用滤纸吸去多余液体；
8. 加入适量的（达到完全浸泡）PBS缓冲液，浸泡3-5分钟，倒掉液体。重复3次；
9.用滤纸吸去多余液体；
10.加入适量的（达到完全浸泡）0.2%考马斯蓝染色液，染20分钟；
11.倒掉染色液。用滤纸吸去多余液体；
12.加入适量的（达到完全浸泡）蒸馏水，浸泡0.5分钟，倒掉液体。重复2次；
12.用镊子撕洋葱内表皮（大小约0.3×0.3cm），放在载玻片上，加盖片，在普通光镜下观察（10×，40×）
五．实验结果：
绘出实验观察到的细胞骨架图；
说明细胞骨架的作用；
二．实验材料及试剂
1、口腔上皮细胞，鼠肝细胞。
2、0.01%吖啶橙生理盐水溶液，0.05%苯胺黑生理盐水液
三．实验内容：
1、细胞活力鉴别：用牙签取口腔上皮细胞，涂于载玻片上，用0.01%吖啶橙染色，兰光激发，观察细胞活性与荧光强弱的关系。
细胞死活鉴别：取鼠肝细胞悬液，滴一滴在载玻片上，加一滴苯胺黑染1-2分钟，在普通光学显微镜下观察。
四．实验结果：记录实验现象并解释。
注：鼠肝悬液：头天取鼠肝用70%乙醇固定，冰箱保存，为死细胞，实验前取新鲜鼠肝、悬浮，为活细胞。观察物中死活细胞均有，用生理盐水悬浮。
1：细胞活力鉴别
实验步骤：用牙签取口腔上皮细胞，涂于载玻片上，0.01%吖啶橙染色约5分钟，兰光激发观察细胞活性与荧光强弱的关系。
2：细胞死活鉴别
实验步骤：取小鼠肝细胞悬液，滴一滴在载玻片上，加一滴苯胺黑染1-2分钟，观察。
1、荧光：当一种波长的光照射某种物质时，这种物质会在极短的时间内发出较入射光波长更长的可见光，这种被激发出的可见光叫做荧光。
①自发荧光：有些生物体受到短波光照射后直接发出荧光；
②次生荧光：生物材料吸附荧光染料后，经短波光照射发出荧光；
2、荧光显微技术：用短波光照射被检物使其发出荧光，然后在荧光显微镜下镜检，观察荧光强弱，颜色分布，从而测定细胞活性，荧光物质的分布及某种结构的有无。
三．实验用品：
0.01% 吖啶橙生理盐水液（DNA专一染料）。
0.02%异硫氰酯荧光素（激发光源：蓝色发绿光）。
0.01%罗丹明生理盐水液（不是线粒体专一性染料，所以整个细胞都能被染色，而线粒体呈亮红色）。
四．实验内容：
1、DNA分布（核）的观察：
撕掉洋葱内表皮，吖啶橙（DNA专-性染料）染色5分钟，生理盐水冲洗，蓝光激发观察（冲洗方法：盐水一滴，吸掉，再一滴，观察）
2、蛋白质分布（细胞）的观察：
撕掉洋葱内表皮，异硫氰酯荧光素染5分钟，盐水一滴，吸掉，再一滴，观察，生理盐水冲洗，蓝光激发。
3、线粒体，细胞骨架观察：
撕洋葱内表皮，罗丹明溶液染5分钟，冲洗，绿光激发（整个细胞红色，靠细胞壁处有小红点为线粒体）。
分别说明实验结果（物质、结构、颜色及分布）。
DNA分布观察：核呈亮绿色，其间可见相间的亮区或条纹呈亮绿色，细胞中也有较亮的绿色条纹。
蛋白质分布观察：液泡处暗，胞质部为亮绿色。
线粒体的分布：整个视眼显红色，能观察出细胞的形态，红亮晶晶的红色小点。
一些荧光染料对活细胞DNA具有特异亲和性，因此荧光素亦可显示凋亡细胞核的形态学特点。荧光色素是目前判别凋亡常用而简便的方法之一。所用的染料有吖啶橙、碘化丙啶荧光素等。也可同时用两种染料进行染色，以确定细胞核的形态学变化和细胞对活体染料的排斥能力，借以区分细胞凋亡和坏死。
吖啶橙染色(AO)法：荧光染料吖啶橙具有两张不同的染色特点，在已固定的组织它是一种异染性染料，单链核酸成橙色荧光，双链核酸橙绿色荧光。在活细胞中它是一种PH指示剂，反映溶酶体质子泵功能，AO呈弱碱性，溶酶体内部的PH值较低，AO可透过细胞膜结构进入溶酶体内，并与其内水性水解酶结合而发橘红色荧光。有研究表明凋亡时伴有整个细胞包括细胞核的酸化。溶酶体在此过程中可能发挥了重要作用。溶酶体可能与把核融合，释放其内容物，降低核内的PH值，促进酸性核酸内切酶的激活，并且溶酶体可能提供酸性环境，促进浓缩核的蛋白成分的分解。凋亡时溶酶体结构基本保持完整，因而可使AO染料进行累积，故凋亡时细胞质及细胞核内均可见致密浓染的橘红色荧光，甚至可见橘红色荧光碎片。而坏死细胞破坏了溶酶体的完整结构，也破坏了累积AO的能力，因而橘红色荧光很浅，甚至没有。
材料洋葱
器材光学显微镜、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、烧杯、镊子
3. 试剂 0.5m/LNaCl,2%双氧水，吖啶橙染液，番红染液
洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡的诱导及形态学观察：
取新鲜洋葱室温下于清水中培养数小时，使其活化，自洋葱鳞茎上切取1cm左右的内表皮若干，分成三组：第一组是正对照，为正常细胞，第二组是试验组，分别于0.5m/LNaCl,2%双氧水中培养，第三组是负对照，为煮沸20min的坏死细胞。3h后分别于番红染液染色5min，吖啶橙染色5min后制片。
注：番红染色的片子在普通显微镜下观察。吖啶橙染色的片子在荧光显微镜下观察。
1、绘出两种染色方法观察到的正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。
2、说明凋亡细胞与坏死细胞的形态学差别。
植物凝集素通常以提取的来源命名，如刀豆素A，麦胚素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是它们的总称。大豆凝集素能特异性结合含N-乙酰基D-半乳糖胺或D-半乳糖的膜糖蛋白，相对分子质量约为120000，等电点为5.81，沉降系数为6S，在超速离心中随7S蛋白一起沉降。大豆凝集素具有典型豆类凝集素的四级结构，为含有4个亚基的四聚体，且每个亚基均含有一个单独的糖结合位点。大豆凝集素每个亚基还分别含有紧密结合的1个钙离子和1个镁离子。它们对于大豆凝集素特异性结合糖的活性是必须的，它们距离糖结合位点0.425nm，处于结合位点的临近效应区，而且按一定的顺序结合，先结合镁离子，然后再其他结合位点结合钙离子。将大豆凝集素加到红细胞中，它与细胞表面的糖外被结合，引起细胞凝集。
材料：土豆块茎，黄豆，兔血。
器材：光学显微镜，电子天平，载玻片，盖玻片，滴管，5ml移液管，研钵，50ml烧杯，单面刀片，吸耳球，注射器，真空采血管。
试剂：PBS（PH=7.2）,抗凝剂，生理盐水。
1 血液处理
兔血：耳缘静脉取血，抽取血液至真空采血管。从真空采血管取50-100vl血液，用生理盐水稀释至3ml。
2 制备凝集素
称取土豆去皮块茎4g，切成小块，置于烧杯内，铺平后沿烧杯内壁缓慢加入10mlPBS，浸泡0.5~1小时，浸出的粗体液中含有可溶性土豆凝集素（注意勿摇）。
取黄豆10粒，研成颗粒状，置于烧杯内，沿烧杯内壁缓慢加入10mlPBS，浸泡0.5~1h，浸出的粗提液中含有可溶性大豆凝集素（注意勿摇）。
3 观察细胞凝集素
用滴管吸取凝集素和红细胞液各一滴，置载玻片上充分混匀，静置后于光学显微镜低倍镜下观察红细胞凝集现象，比较土豆凝集素和大豆凝集素对红细胞的凝集反应差异。同时，设只加凝集素提取液或红细胞液的空白对照，观察细胞状态。
注意事项
取血液时使用专用吸管，以免造成血液污染。
绘制简图说明红细胞凝集的原理
绘制所观察到的细胞凝集效果图
实验十一 染色体提前凝集标本制备实验
通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。
1. 在自然条件下或用人工的方法（物理、化学或生物）将两个或两个以上的同种或不同种细胞融合成一个细胞的过程称为细胞融合。
2. 七十年代初，由于发现 M 期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法，即让M期细胞与间期（I 期）细胞融合，从而诱导 I 期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体（Prematurely Condensed Chromosome， PCC）。这项技术已应用于细胞周期分析、正常细胞和肿瘤细胞染色体的微细结构的研究、多种因素作用细胞使染色体损伤及修复效应的研究，预测某种血液病的病程、愈后及复发的临床实践等方面。
1.器材
光学显微镜、离心机、水浴箱、热吹风机、 10ml刻度离心管、 5号针头注射器、试管架、 试管夹、染色槽、废液缸、冰冻载玻片、吸水纸、擦镜纸、香柏油瓶、记号笔、酒精灯。
2.材料
人宫颈癌上皮细胞（ Hela细胞）。
3.试剂
0％PEG、 Hanks液（ pH7.4） 、 RPMI－1640培养基（含10％灭活小牛血清， pH7.4） 、 10ug/ml秋水仙素、 0.075mol/L KCl低渗液、 0.2％次甲基兰染液、 1/15mol/L PBS、 Carnoy固定液、Giemsa染液。
四．实验内容
1.收集培养的M期Hela细胞：
（1）取一瓶处于对数生长期的Hela 细胞，向培养基中加入10ug/ml的秋水仙素使终浓度为0.04ug/ml。
（2）在37℃二氧化碳培养箱中继续培养12h，使大量生长的细胞被阻断于M期；
（3）每组取一瓶经上述处理的细胞，以平行于细胞生长面方向反复振摇，使培养液不断冲刷细胞层（或用吸管吹打），M期细胞因变成球形容易脱离瓶壁而悬浮；
（4）将含有M期细胞的培养基移入离心管中，1000rpm离心5min；
（5）弃去上清，加入5ml Hanks液，用吸管吹打成细胞悬液。
2.收集培养的Hela细胞：
（1）取一瓶生长良好的Hela 细胞，弃去培养基；
（2）加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2-3min，弃去胰酶消化液；
（3）加入5ml Hanks液，用吸管吹打成单个悬浮细胞备用。
3. 50％ PEG的制备：
（1）称取0.5g PEG（ MW 4,000） ，倒入离心管中；
（2）在酒精灯上加热使之融化（约为0.5ml）；
（3）再加入预热的Hanks液0.5ml，混匀，置37℃水浴中待用。
4.细胞融合：
（1）将上述两管细胞倒入一个离心管中充分混匀，1000rpm 离心5min，弃上清，再小心地吸尽残液；
（2）用指弹法弹散细胞，在37℃水浴条件下吸取0.5ml 50％ PEG，逐滴加入离心管中， 并不断地轻轻摇动，整个过程约90秒钟；然后，迅速加入5ml Hanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴中静置5min；
（3）1000rpm离心5min，弃上清，加入2ml含有血清的RPML-1640培养基，同时用5号针头的注射器垂直加入10ug/ml 的秋水仙素1滴，轻轻吹打成悬液，37℃水浴中温育30～60min；
5.制备PCC标本
（1）细胞温育后，以1000rpm离心5min，弃上清，加入10ml 0.075mol/L KCL低渗液轻轻制成悬液；
（2）在37℃处理25min左右，终止时加入1ml Carnoy固定液进行固定；
（3） 1000rpm离心8min，弃上清，指弹离心管底部使细胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30min；
（4） 1000rpm离心5min，弃去上清，留0.2ml残液，用吸管轻轻吹打成悬液；
（5）取预冷的载玻片，制一张滴片，烤干；
（6） Giemsa染色15min左右，水洗，干燥后镜检。
1.根据观察结果，绘出观察到的不同形态的提前凝集染色体。
实验十二 APK信号通路与乳腺癌细胞增殖及可能机制的探索性实验
1. 探讨乳腺癌细胞中MAPK信号转导通路异常激活与乳腺癌细胞增殖的关系及可能机制。
2. 掌握westernblot实验的原理及操作过程。
3. 掌握检测细胞生长情况的三种不同方法。
1. 皮生长因子受体（ epidermal growth factorreceptor,EGFR）属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶，是原癌基因ErbB1(HER1)的表达产物。 EGFR广泛分布于哺乳动物的上皮细胞膜上，其信号可介导细胞的生长、增殖、分化、黏附、移动等生命现象。研究表明，包括乳腺癌、胃癌、结肠癌等多数肿瘤上皮可高表达EGFR，常与肿瘤生长、 侵袭转移、血管生成等密切相关，因此， 已成为肿瘤治疗的重要靶点。
2. 在 EGFR的信号转导通路中， 比较经典的通路是有丝分裂原活化蛋白激酶（ mitogenactivatedproteinkinase, MAPK）途径：EGF→EGFR→Grb2→SOS→Ras→raf→MEK
→MAPK，最后入细胞核调控细胞周期相关基因的表达，导致细胞异常增殖。MAPK 信号通路主要包括ERK1/2、 JNK、 p38MAPK。通常定位于细胞质中,受激活后移行进入细胞核，并产生相应的生理作用。
3. 用表达人野生型ERK1/2基因全长cDNA 的真核载体pcDNA3.1 转染人乳腺癌细胞（MCF-7），在EGF刺激下，以生长曲线、 MTT法检测ERK1/2对乳腺癌细胞生长和增殖的影响，并利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨ERK1/2对乳腺癌细胞周期的影响。此外， 采用Westernblot技术检测乳腺癌细胞中磷酸化ERK1/2蛋白的活性以及对相应细胞周期起调节性作用的细胞周期素（主要为cyclinD1）和与细胞生长有关的c-myc基因的表达情况。最后，将ERK1/2基因导入绿色荧光蛋白（GFP）载体转染MCF-7，在荧光显微镜下观察EGF刺激前后ERK1/2在细胞中定位的变化。通过对以上实验结果的分析，探讨乳腺癌细胞中ERK1/2信号转导通路异常激活对乳腺癌细胞增殖的影响及可能机制。
微量加样器、枪头、离心管、 电泳仪、转印槽、 荧光显微镜、 酶标仪、流式细胞仪、BIO-RAD转印仪、 水平摇床、恒温水浴箱、 PCR扩增仪、低温高速离心。
MCF-7 细胞。
脂质体、 台盼兰、MTT液、 盐酸、 异丙醇、 乙醇、PI染液、EGF、 磷酸盐缓冲液、p-ERK 1/2抗体、ProteinA–sepharose、激酶缓冲液、髓鞘碱性蛋白、Laemmli缓冲液、脱脂奶粉、TBST、cyclinD1抗体、c-myc抗体、绿色荧光蛋白载体（pEGFP-C1）、Tris，甘氨酸，灭菌去离子水、 甲醇、 Tween20、 ECL发光kit、 M-MuLV反转录酶、氯仿、Trizol、TaqDNA聚合酶、引物、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂Kit、聚丙烯酰胺。
1. 检测ERK1/2对乳腺癌细胞生长的影响：
1）野生型ERK1/2 基因真核表达载体的构建及鉴定。
（1）织细胞RNA的纯化：
① 弃细胞培养基质，加1mlTrizol试剂至培养瓶中，吸头冲洗若干次，直至贴附在瓶壁上的细胞脱落，将细胞分解物移入到1.5mlEP管中，样本在室温下静置1～5min；
② 样品中加0.2ml氯仿，振摇15s，然后室温静置2～15min；
③ 离心15min（ 12000×g， 2～8℃）；
④ 吸取离心后上层水相0.4～0.5ml到新的EP管中，加入0.5ml/1mlTripure试剂异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置5～10min；
⑤ 离心10min（ 12000×g， 2～8℃），弃上清；
⑥ 加入1ml75%乙醇，振摇数次；
⑦ 离心5min（ 7500×g，2～8℃），弃上清；
⑧ 真空干燥（或者自然干燥）后，用 DEPC处理过的蒸馏水30-40ul溶解沉淀， 55～60℃孵育10～15min；
⑨ 测量OD值后，样品放置-70℃保存。
（2）M-MuLV反转录酶（ RNaseH-）进行第一链cDNA的合成：
① 在无菌管中加入以下样品：
② 70℃加热5min，短暂离心后放置于冰上；
③ 混合以下样品：
④ 42℃温育1hrs；
⑤ 95℃5min使酶失活；
⑥ 加RNaseH1μl， 37℃作用20min降解RNA，然后95℃5min使酶失；。
⑦ 用无核酸酶污染水将反应体系稀释到50μl，取2～5μl进行PCR扩增反应。
（3）PCR反应扩增ERK1/2基因片：
① 按下列组分配制PCR反应液：
② PCR反应条件：
③ 琼脂糖凝胶电泳检测结果：
（4）凝胶回收PCR反应片段：
A. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率；
B. 称量胶块重量，计算胶块体积（按照1mg=1μl）；
C. 向胶块中加入胶块融化液DE-ABuffer， DE-ABuffer的加量如下表：
D. 均匀混合后， 75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热）。此时应间断振荡（2-3min）混合，使胶块充分融化（约6～8min）；
E. 向上述胶块融化液中加入DE-ABuffer量的 1/2体积量的DE-BBuffer，均匀混合，当分离的DNA片段小于400bp时，加入一个凝胶体积的异丙醇；
F. 将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上；
G. 将上述操作5的溶液转移至SpinColumn中， 12000g离心1min，弃滤液；
H. 将500μl的BufferW1加入SpinColumn中， 12000g离心30Secs，弃滤液；
I. 将700μl的 BufferW2（确认BufferW2中已加入无水乙醇）加入SpinColumn中，
12000g离心30Secs，弃滤液；
J. 重复步骤9，然后12000g再离心1min， 12000g再离1min；
K. 将SpinColumn安置于新的EP管中，在SpinColumn膜的中央处加入25-30μl的水或Eluent，室温静置1min；
L. 12000rpm离心1min洗脱DNA。
（5）将ERK1/2克隆到pcDNA3.1真核表达载体：
① 用限制性内切酶对ERK1/2目的基因和载体分别进行双酶切反应体系（20ul体系）；
② 凝胶回收酶切产物；
③ ERK1/2目的基因和载体的连接；
反应体系：
室温2hrs，或者4℃过夜。
（6）转化感受态细胞
① 100ul感受态细胞在冰中融化；
② 分装2管， 50ul/管；
③ 加入连接产物5ul；
④ 冰中放置30min；
⑤ 42℃放置45～60sec；
⑥ 冰中放置2～3min；
⑦ 加入37℃预温好的SOC培养基， 250μl/管；
⑧ 37℃振荡培养1hrs；
⑨ 涂平板， 100μl/管。 37℃温箱培养 12～16hrs。
（7）提取质粒并进行酶切鉴定：
① 挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3ml LB液体培养基中，37℃， 225rpm培养12～16hrs；
② 提取质粒；
a. 离心菌液12000rpm，1min， 废弃上清；
b. 加入100ulSolutionⅠ，使菌片重悬，务必使片状物不可见；
c. 加入200ulSolutionⅡ，上下颠倒EP管4～6次，操作时间要少于5min；
d. 加入150ulSolutionⅢ，上下颠倒EP管4～6次，可见絮状沉淀；
e. 离心13000rpm，10min；
f. 离心后的上清液移入PrepSpinColumn；
g. 13000rpm离心30～60Secs，弃滤液；
h. 加入0.5ml BufferPB， 13000rpm离心30～60Secs，弃滤液；
i. 加入0.75mlBufferPE， 13000rpm离心30～60Secs，弃滤液；
j. 13000rpm再离心1min，弃滤液；
k. 将PrepSpinColumn加到新的1.5ml EP管上；
l. 加50ulBufferEB至滤膜中央，室温静置 1min，13000rpm离心 1min，即获得所需质粒。
③ 酶切鉴定：
反应体系（20ul体系）：
④ 电泳：观察酶切结果。
2）pcDNA3.1-ERK1/2质粒转染MCF-7 细胞
（1）转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖；一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数。
（2）转染当天， 加入脂质体/DNA混合物之前的短时间内， 更换1ml无血清无抗生素的DMEM培养液培养2-24h。
（3）混合A溶液于一个1.5ml离心管中：质粒DNA（ 1-2ug）溶于100ul无血清培养基,轻轻混匀。
（4）混合 B溶液于另一个 1.5ml离心管中：脂质体试剂溶于 100ul无血清培养基中，混匀，室温孵育5min；当 A溶液孵育5min后，混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡） ，室温孵育20min，以便脂质体/DNA混合物形成。
（5）加800ul无血清培养基，混匀后，逐滴加入细胞表面，37℃，5% CO2培养箱内培养3hr。
（6）3h后，用新鲜 2-3ml含血清培基更换含有转染复合物的不完全培养基，继续培养36-72h。以空白对照和转染空pcDNA3.1质粒作为阴性对照。
3）细胞生长曲线
在24 孔板中每孔加入1 ×104个细胞,每隔24h 消化并用台盼蓝染色计数3 孔内活细胞数,连续7d ,绘制细胞生长曲线。
4）MTT法检测细胞生长情况
在96 孔板中每孔加入2×104 个细胞,第3 天加入浓度为5g·l-1的MTT液20μl，37℃作用4h，弃MTT液，每孔加入盐酸异丙醇200μl，然后用酶标仪测定OD 值。
5）流式细胞术检测细胞周期
（1）胰酶收集1×106 个细胞，
（2）用预冷的磷酸缓冲盐溶液洗1-2次，
（3）70%预冷的乙醇固定40min，
（4）用预冷的磷酸缓冲盐溶液洗1次，
（5）加1ml PI 染液闭光染色30min,细网过滤,于流式细胞仪上进行检测，根据测定的结果分析，哪类细胞周期素在此过程中可能参与了细胞周期调控。
2. 检测乳腺癌细胞中ERK1/2激酶活性以及细胞周期素（推测主要为cyclinD1） 与c-myc基因的表达情况
1）EGF刺激因子刺激MCF-7细胞并收集蛋白
（1）将细胞种植于直径为60mm的培养皿中，
（2）待细胞约90％长满时，静息24h，用10ng/ml EGF作用细胞5min，未加EGF的细胞作为空白对照，
（3）预冷磷酸盐缓冲液冲洗3遍，
（4）加入裂解液收集裂解的细胞，涡旋2次，
（5）置于冰盒中静止15min，离心后将上清移至新EP管中。
2）ERK1/2激酶活性分析
（1）各组蛋白提取液20μl，含蛋白总量约100μg，
（2）加5μg p-ERK1/2抗体，4℃ 沉淀4h，
（3）加30μl ProteinA-sepharose 混悬液沉淀抗原抗体复合物1 h，
（4）免疫沉淀缓冲液漂洗ProteinA -sepharose 抗原抗体复合物3次后,再悬浮于激酶缓冲液(含25mmol/l Tris-HClpH7.4,10mmol/LMgCl2，1mmol/l DTT，40mmol/l ATP，7.4×104Bq［γ-32P］ATP，2mmol/l蛋白激酶抑制剂和0.5 mmol/l EGTA)，
（5）再与25mmol/L髓鞘碱性蛋白（myelin basicprotein，MBP）25℃反应10min，
（6） 加入Laemmli缓冲液(0.002%溴酚蓝， pH 7.0的10 mmol/l磷酸盐缓冲液， 10%甘油，0.4%SDS，1% 2-巯基乙醇)终止反应，
（7）样本煮沸5min，取上清液电泳后，放射自显影观察ERK1/2激酶活性。
3）western印迹检测 EGF刺激前后细胞周期素cyclinD1与c-myc基因的表达情况
（1）结合流式细胞术的结果，取各组蛋白提取液20μl行SDS-PAGE电泳，
① 配制并灌注分离胶，配方见下表1，
② 分离胶凝固后灌注浓缩胶，配方见下表2，
③ 制备样品并进行电泳，用适当体积的1×SDS凝胶加样缓冲液处理样品，100℃加热5min，使蛋白变性，
④ 按预定顺序加样，加样量15u1，在不同的样品孔中加等体积的1×SDS凝胶加样
缓冲液，
⑤ 将电泳装置与电源相连， 110V恒压电泳60min。
（2）转膜
① 将电泳后的胶取出，浸入转印缓冲液平衡15min，
② PVDF膜在甲醇中短暂浸泡，在转印缓冲液中浸泡15~30min，
③ 将专用滤纸和垫片浸泡于转印缓冲液中，
④ 安装电泳“三明治”，应在转印液中进行，安装顺序为：
阳极-垫片-专用滤纸-PVDF膜-蛋白PAGE胶-专用滤纸-垫片-阴极
⑤ 45V恒压，于4℃电转过夜，
⑥ 电泳结束后，切除膜多余部分，切角标记方向。
（3）杂交
① TBST洗膜，3×15min/次，
② 加封闭液（ 5%脱脂奶粉-TBST溶液），在摇床上振摇3Hrs，
③ TBST洗膜， 3×15min/次，
④ 1：5000稀释抗体，PVDF膜在抗体中孵育2hrs，
⑤ TBST洗膜，1×15min/次，然后3×5min/次。
（4）ECL反应
① 将ECL试剂盒内的溶液1与溶液2以1：1的比例混合于避光离心管中，待用，
② 将PVDF膜从TBST洗液中夹出， 将膜的边缘放在吸水纸上吸去液体， 将PVDF
膜放于准备好的一张透明塑料薄片之上，
③ 将混合的ECL均匀滴在PVDF膜上，避光反应1min，
④ 将ECL倒回离心管中，
⑤ 用另一片塑料片压在PVDF膜上（注意不要出气泡），用透明胶固定于X光片
夹内，准备曝光，
⑥ 在暗室裁好底片，大小与膜相当，压片数秒钟，
⑦ 显影剂中显影～2min，自来水冲洗后放于定影剂>2min，自来水冲洗，晾干，
⑧ 根据显影效果确定下一张片子的曝光时间的长短，
⑨ 将晾干的片子贴在膜上， 在片子上标记出Marker所在的位置以及蛋白样品的名称，所用抗体，操作者和试验日期，PVDF膜4℃保存。
3. ERK1/2激酶在细胞内的定位
1）构建ERK1/2-pEGFP-C1真核表达载
（1）双酶切ERK1/2目的基因和pEGFP-C1载体，
（2）ERK1/2目的基因和pEGFP-C1载体连接，
（3）重组质粒的转化、筛选和鉴定，
2）ERK1/2-pEGFP-C1质粒转染MCF-7 细胞
采用脂质体转染法，将ERK1/2-pEGFP-C1 转染MCF-7细胞，以空白对照和转染空GFP 质粒作为阴性对照，36~72小时后，在荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布，确定ERK1/2激酶在细胞内的定位。
3）加入EGF处理细胞10min后，在荧光显微镜下观察ERK1/2激酶在细胞内定位的变化，推测其可能具有的功能。
1.根据观察结果，绘出ERK1/2-pEGFP-C1 转染后MCF-7细胞内绿色荧光分布图，并说明ERK1/2激酶在细胞内的定位。
2. 绘出加入EGF后ERK1/2激酶在细胞内定位的变化情况。
3. 写出你推测得到的ERK1/2激酶的功能。
实验十三 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察
1. 通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义。
2. 掌握小白鼠腹腔注射给药和颈椎脱臼处死方法。
巨噬细胞起源于骨髓，经血液进入组织中而成，分布于全身各处，当机体受到某些损伤因素时（如微生物或其它病原体或异物侵入），能招引巨噬细胞，同时巨噬细胞有趋化性，主动向病原体或异物游走，在接触到病原体或异物时，细胞膜凹陷伸出伪足包围异物，并发生胞吞作用形成吞噬泡，继而巨噬细胞质中的溶酶体与吞噬泡融合，消化分解异物。 含台盼蓝的淀粉肉汤，可使腹腔中有较多的巨噬细胞，以供观察吞噬活动。
1. 材料
小白鼠、1%鸡红细胞悬液
1%鸡红细胞悬液制备：从集市买一只健康活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever溶液瓶中，混匀后置4℃冰箱保存备用（2 周内使用）。使用前，取用Alsever’s 液保存的新鲜鸡血5ml ， 加入8ml 的0.85% 的NaCl 溶液，小心混匀，1500 r/min 离心5min，如此洗涤3 次，最后配成1%的鸡红细胞悬液。
2. 仪器设备
显微镜、注射器、注射针头、吸管、试管架、剪刀、解剖刀、解剖镊、载玻片、盖玻片。
3. 试剂
① 0.85%生理盐水
② 4%台盼蓝染液：称0.2g台盼蓝，再加入0.85%生理盐水50 ml即可。
③ 6%的淀粉肉汤（含台盼蓝染液）：
将0.3g牛肉膏、1.0g蛋白胨、0.5g氯化钠放入100 ml蒸馏水中，加热后加入可溶性淀粉6.0g，溶解后煮沸灭菌，置4℃冰箱保存。用时水浴融化，加入适量4%台盼蓝染液混匀，使其呈蓝色。
④Alsever溶液：
称取2.05g葡萄糖、 0.89g柠檬酸钠Na9C6H5O7.2H2O)、0.05g柠檬酸（C6H6O7.H2O）和 0.42g氯化钠，用蒸馏水定容至100ml，调PH 至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置4℃冰箱保存。
四、实验内容
1. 实验前一天，给小白鼠腹腔注射6％淀粉肉汤液(含台盼蓝)1毫升（连续注射三天效果较好）。
2. 实验时，每组取一只注射过淀粉肉汤的小白鼠，腹腔注射1%鸡红细胞悬液1ml，25分钟~30分钟后再向腹腔注射0.9%生理盐水1ml，并用手轻揉小鼠腹部，有利于悬液分散。3分钟后，用颈椎脱臼方法处死小鼠（一手捏着鼠头、颈连接处，一手捏住鼠尾，分别向两端用力牵拉，直到拉死为止），迅速剖开腹腔，用不带针头的注射器贴腹腔背壁处直接抽取腹腔液，滴片，制备一张临时装片，盖上盖玻片。放置2分钟~3分钟后在显微镜下观察。
注：剖开小鼠腹腔时，剪刀头要向上，以避免剪破腹腔血管，腹腔液应是无色的液体
[实验结果]
在高倍镜下，可见到圆形或形状不规则的巨噬细胞，其胞质中含有数量不等的蓝色颗粒（为吞入的含台盼蓝的淀粉肉汤形成的吞噬泡），还可见少量淡黄色椭圆形有核的鸡红细胞。慢慢移动玻片标本，仔细观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程：有的鸡红细胞（一个至多个）紧贴于巨噬细胞表面；有的巨噬细胞已将一至数个鸡红细胞部分吞入；有的巨噬细胞已吞入了一个或几个红细胞，形成了椭圆形吞噬泡；有的巨噬细胞内的吞噬泡已与溶酶体融合正在被消化，体积缩小呈圆形。
1. 在高倍镜下绘制小鼠巨噬细胞吞噬鸡血红细胞的过程图（绘制不同吞噬阶段的巨噬细胞图各一个），示巨噬细胞吞噬作用的全过程。
2. 计算：吞噬指数和吞噬百分率
3. 巨噬细胞吞噬鸡红细胞摄影：数码相机摄影，处理，随绘制的过程图附上。
实验十四 免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原
了解特异性免疫荧光抗体反应的一般过程及其在细胞学研究中的应用。
用人结肠癌细胞为免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人结肠癌细胞表面抗原(Ag)的单克隆抗体IgG（第一抗体），二者可以发生特异性的抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物，再加入市售(也可自制)的荧光标记的羊抗鼠IgG抗体（第二抗体），可以与复合物进一步发生抗原抗体反应（二次抗体反应），这样就可以在荧光显微镜下观察到这种抗原在结肠癌细胞表面的存在（图14-l）。
人体结肠癌培养细胞、HeLa细胞、小鼠抗人结肠癌细胞抗体(第一抗体)、荧光标记羊抗鼠抗体（第二抗体）。
2. 器材和仪器
盖片、载片、培养瓶、培养皿、滤纸、镊子、吸管、普通倒置显微镜，荧光显微镜、微量加样器。
1640培养液(加10％小牛血清)、甲醛固定液、0.01mol/L PBS(Ph7.2)、液体石蜡。
1．将培养瓶中的结肠癌细胞接种到装有盖片的培养皿中，培养2～3天；
2．在倒置镜下观察到盖片上的细胞生长状态良好后，在盖片左上角用玻璃笔做一下标记，以免在以后的操作中正反面颠倒；
3．将盖片放在甲醛固定液中，4℃固定5~10分钟；
4．用PBS洗三次，注意不要将PBS液直接倒在盖片的细胞面，以免引起细胞大量丢失。用滤纸片将盖片上的PBS轻轻吸干，不要损伤细胞层；
5．将已稀释好的小鼠抗体滴在盖片上．每个盖片50μl，37℃温育30分钟；
6．用PBS洗三次，滤纸吸干；
7．将已稀释好的荧光标记羊抗鼠二次抗体5μl滴加在盖片上，37℃温育30分钟；
8．用PBS洗三次，滤纸吸干；
9．将载片上滴一滴液体石蜡，然后将盖片细胞面朝下放到载玻片上，在荧光显微镜下观察。
1. 绘出你所观察到的结果；
2. 回答以下问题：
① 三次用PBS清洗的目的各是什么？
② 为排除荧光标记的羊抗鼠抗体直接与人结肠癌细胞表面某种抗原发生反应的可能性，你认为还应设立什么样的对照组?
（四）实验考核与成绩评定
1．考核方式：
实验报告 、出勤
2．成绩评定
实验总评成绩＝实验报告占实验总成绩70％，出勤30%。
五、课程考核与成绩评定
（一）考核方式：
考试；笔试；闭卷。实验内容根据实验报告和实验操作进行考核。
（二）成绩评定：
课程总评成绩＝考试试卷成绩占60％，实验、作业、出勤占总成绩40％。
表4 平时考核方式及权重举例
平时考核类型
作业
出勤
权重（％）
10%
表5 试题类型及权重举例
试题类型
名词解释
选择
判断
填空
问答题
20%
24%
16%
30%
六、推荐教材、参考书及网络资源
（一）教材
[1]翟中和·细胞生物学·北京·高教出版社，2011.06
[2]王金发·细胞生物学·北京·科学出版社，2003.08
[3]潘大仁·细胞生物学·北京·科学出版社，2007.7
（二）参考书
[1]张静波·细胞生物学复习纲要与解题·北京·清华大学出版社，2009.01
[2]韩贻仁·分子细胞生物学·北京·科学出版社，2001年。
[3]Bruce Alberts et al·细胞生物学精要·北京·科学出版社，2012.03
（三）网络资源：
生物谷，生物通，小木虫，生物软件网，丁香园。
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